超声波-微波协同辅助提取碱蓬多糖及抗氧化性分析

李煦，徐美，吴玉文，周自成，范小振

（沧州师范学院化学与化工学院，河北 沧州 061001）

盐地碱蓬（Suaeda salsa）又名黄须菜、海英菜，是一种抗盐能力出众、生命顽强的盐碱地指示植物，能有效减少盐碱地区土壤表层含盐量[1]，提高土壤动植物有机质含量，改善土壤环境，是近年来改良、开发盐碱土壤的首选植物，能够取得较好的生态、经济效益[2]。盐地碱蓬富含营养，其种籽油含油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸；茎叶中含有大量维生素和多种微量元素。近年来，对盐地碱蓬的研究，主要集中在其种籽油的提取[3]、总黄酮的提取测定[4]及其中无机元素的确定[5]。多糖是由多个单糖通过脱水形成的糖苷链，具有降血糖[6]、抗肿瘤[7]、调节机体免疫[8]、抗氧化[9]、抗衰老等功效。目前对盐地碱蓬中多糖提取工艺的研究相对较少，且效率较低。因此，迫切需要开发出一条时间短、效率高、工艺简单的碱蓬多糖提取工艺，为进一步开发盐地碱蓬的经济价值，保持和重建盐碱地生态，提高盐碱土壤农产品附加值提供智力支持。

提取植物多糖的方法有水提法、碱提法、酶提法、微波辅助法、超声波辅助法、超声-微波协同法等。刘玉芬等[10]采用水提法提取碱蓬多糖，最佳提取条件为：提取温度 87 ℃、提取时间 3.5 h、液料比 31.5 ∶1（mL/g），在此条件下碱蓬粗多糖得率为2.028%。该方法虽成本低廉、操作简单，但得率较低。庞庭才等[11]采用碱提法提取碱蓬多糖，最佳提取条件为：NaOH 溶液浓度0.17 mol/L，料液比 1 ∶42.5（g/mL）、提取温度 83.5 ℃、提取时间3.4 h，此条件下多糖提取率较水提法大大增加，为8.00%。马波等[12]对酶法辅助超声波提取盐地碱蓬多糖进行了研究，在碱性果胶酶加入量为0.4 %，pH 10，料液比 1 ∶25（g/mL），超声温度 45 ℃，时间20 min，超声功率120 W 的条件下，碱蓬多糖提取率可达8.56%。使用超声波辅助提取可缩短提取时间，降低提取温度[13-14]。但超声波辅助提取热效应不强，在提取过程中难以达到足够高的提取温度[15]，超声-微波协同法将微波与超声波的优点结合，使植物细胞内部多糖从细胞中释放出来的效率更高，速度更快[16-17]。

目前，超声-微波协同辅助提取盐地碱蓬多糖的报道尚未见到。文中采用超声-微波协同法辅助提取盐地碱蓬茎叶多糖，并通过响应面分析法优化碱蓬多糖的提取工艺，以期为盐地碱蓬资源的进一步开发利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

盐地碱蓬茎叶粉末：采集于河北省沧州市沿海地区，40 ℃干燥至恒重后，用粉碎机粉碎20 s，过60 目筛，密封备用。

硫酸亚铁、无水乙醇、双氧水（30%）、葡萄糖、苯酚：均为分析纯试剂，天津市永大化学试剂有限公司；抗坏血酸（VC）、叔丁基对苯二酚（tert-butylhydroquinone，TBHQ）、 三 羟 基 氨 基 甲 烷（trihydroxy aminomethane，Tris）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：均为分析纯，国药集团上海化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

XO-SM200 型超声波微波组合反应系统：南京先欧仪器制造有限公司；UV-2550 型紫外分光光度计：日本岛津公司；TDL-5 型低速台式大容量离心机：江苏省金坛医疗仪器厂；FA2004N 型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；SL-100 型高速多功能粉碎机：浙江省永康市松青五金厂；101A-1E 型电热鼓风干燥箱：上海实验仪器厂有限公司；HHS-11-1 型电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 盐地碱蓬茎叶中多糖的提取与测定

按照一定料液比，准确称取一定质量的盐地碱蓬茎叶粉末，添加80 mL 蒸馏水，混合均匀后，设定超声-微波协同提取条件进行多糖的提取，离心，上清液为多糖溶液。

盐地碱蓬茎叶中多糖的测定采用苯酚-硫酸法[18-19]，得率的计算按照如下公式：

式中：K 为盐地碱蓬茎叶多糖得率，%；n 为稀释倍数；C 为测得多糖溶液质量浓度，g/mL；V 为提取液体积，mL；M 为盐地碱蓬样品质量，g。

以葡萄糖溶液质量浓度为X 轴，以吸光度为Y轴，绘制出绘制标准曲线，可得多糖回归方程为：Y=7.235 7X-0.008 3，R2=0.996 6。

1.3.2 单因素试验

依据上述提取方法，以蒸馏水为提取剂，选择超声功率、料液比、提取温度、提取时间4 个因素作为变量对盐地碱蓬茎叶中多糖提取工艺进行研究。在试验过程中，固定微波功率200 W，各因素的考查范围分别为：超声功率 120、240、360、480、600 W；料液比 0.3 ∶80、0.5 ∶80、0.7 ∶80、1.0 ∶80、2.0 ∶80、3.0 ∶80（g/mL）；提取温度 40、50、60、70、80 ℃；提取时间 5、10、15、20、25 min。

1.3.3 响应面试验设计

在微波功率200 W 条件下，根据响应面分析法中Box-benhnken 的中心组合试验设计原理，以料液比、超声功率、提取时间、提取温度4 个因素为自变量，设计四因素三水平共29 个试验点的响应面分析试验，响应面因素水平表如表1所示。

表1 响应曲面设计试验因素水平和编码Table 1 Independent variables and their levels used in the response suiface design

1.3.4 抗氧化性分析

1.3.4.1 清除羟基自由基活性测定

将6.3 mmol/L 硫酸亚铁溶液和6.7 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液各2.00 mL 均匀混合，添加不同质量浓度（0.38、0.95、1.90、2.85、3.80、5.10 mg/mL）的盐地碱蓬多糖溶液2.00 mL，启动反应时添加8.8 mmol/L 双氧水，静置10 min，取上层清液于510 nm 处测定吸光度，计算清除率。配置同等浓度梯度的VC溶液，在相同条件下测定吸光度，进行对照[20]。

清除率计算公式如下：

式中：Ai为样品吸光度；Ai0为以蒸馏水代替双氧水的吸光度；A0为以蒸馏水代替样品的空白吸光度。

1.3.4.2 清除超氧阴离子自由基活性测定

取 4.5 mLTris-HCl 缓冲溶液（pH 8.2），25 ℃预热10 min，加入0.1 mL 不同质量浓度的碱蓬多糖溶液，均匀混合后于25 ℃水浴静置10 min，加入邻苯三酚于25 ℃水浴反应10 min，加入HCl 终止反应，测定325 nm处吸光值。用蒸馏水代替碱蓬多糖溶液，采用同样方法进行对照试验，计算样品对超氧阴离子自由基的清除率[21]。清除率计算公式如下：

1.3.4.3 清除DPPH活性测定

取不同质量浓度的碱蓬多糖溶液各1.0 mL，加入DPPH 溶液，避光反应30 min 后，于517 nm 处测定吸光值，计算样品对DPPH·的清除率[22]。清除率计算公式如下：

式中：Ai为DPPH·与样品混合溶液的吸光值；Ai0为样品与无水乙醇混合液的吸光值；A0为DPPH·与蒸馏水混合溶液的吸光值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对盐地碱蓬多糖得率的影响

以蒸馏水为提取剂，在微波功率200 W，提取温度70 ℃、超声功率360 W、提取时间15 min 的条件下，考察不同料液比对盐地碱蓬多糖得率的影响，结果如图1所示。

图1 料液比对得率的影响Fig.1 Effect of soild-liquid ratio on the extraction rate

由图1可见，随料液比增大，多糖得率呈现先升高后下降趋势。在0.5 ∶80（g/mL）时得率最高，为9.7%。料液比增加，多糖的溶出量随之增加，得率升高；当料液比继续增大，多糖溶出可能达到饱和，但加入的物料质量在增加，导致得率降低[23]。所以料液比选择0.5 ∶80（g/mL）。

2.1.2 提取时间对盐地碱蓬多糖得率的影响

2.3 引产期间胎盘娩出情况 本组48例引产者中有44例胎儿及胎盘附属物完全自行娩出，另有2例胎盘及其附属物娩出不彻底，行B超引导下清宫术辅助终止妊娠，2例药流联合水囊引产失败后行钳刮术，完全流产率为91.7 % (44/48)。引产成功病例中产后清宫率4.3%(2/46)。

在微波功率 200 W、料液比 0.5 ∶80（g/mL）、提取温度70 ℃、超声功率360 W 的条件下，考察不同提取时间对盐地碱蓬多糖得率的影响，结果如图2所示。

图2 提取时间对得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate

由图2可见，随提取时间延长得率呈先升高后下降趋势，在20 min 时达到最高，为9.8%。可能在提取时间较短时，多糖释放不充分；提取时间延长后，细胞破碎程度加大，溶出量提高，得率也提高；当超过20 min后，得率降低，可能是盐地碱蓬多糖在较长时间的超声波作用下结构和性质发生了变化，如降解为单糖[24-25]，导致多糖得率的降低。因此提取时间选择20 min。

2.1.3 提取温度对盐地碱蓬多糖得率的影响

在微波功率 200 W、料液比 0.5 ∶80（g/mL）、超声功率360 W、提取时间20 min 的条件下，考察不同提取温度对盐地碱蓬多糖得率的影响，结果如图3所示。

图3 提取温度对得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate

由图3可见，随着提取温度的升高，得率呈先上升后下降的趋势；在70 ℃时得率达到最高。升高温度有助于溶剂的渗透和多糖的扩散；超过70 ℃后，水分蒸发量增加明显，可能对多糖的溶出造成不良影响，温度过高也可能使多糖结构发生改变，导致已溶出多糖的降解，从而使碱蓬多糖得率降低[26-27]。所以提取温度选择70 ℃。

2.1.4 超声功率对盐地碱蓬多糖得率的影响

在微波功率 200 W、料液比 0.5 ∶80（g/mL）、提取温度70 ℃、提取时间20 min 条件下，考察不同超声功率对盐地碱蓬多糖得率的影响，结果如图4所示。

图4 超声功率对得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction rate

由图4可见，随超声功率增大得率呈先升高后下降趋势；在360 W 时达到最高，为9.8%。原因可能是超声功率较小时作用力不强，细胞破碎程度不足，多糖溶出较少；较高功率的超声波会降低空化作用，使气泡塌缩程度不足[28]，导致多糖得率下降。因此，超声功率选择360 W。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计方案及结果

在微波功率200 W 条件下，根据响应面分析法中Box-benhnken 的中心组合试验设计原理，以提取时间（A）、料液比（B）、提取温度（C）、超声功率（D）为自变量，设计四因素三水平共29 个试验点的响应面分析试验。结果如表2所示。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 RSM design and results

2.2.2 回归模型方差拟合及结果分析

利用Design Expert 8.0.6 统计软件对响应面试验数据进行回归分析，得到结果如表3所示。经二次多元回归拟合，得到回归方程如下：

提取率/%=-62.238 75+1.221 00A+38.041 67B+1.058 17C+0.074 632D+0.050 000AB-4.500 00×10-3AC-4.166 67×10-5AD+0.050 000BC+1.041 67×10-3BD+3.261 28×10-18CD-0.052 290 0A2-42.125 00B2-7.100 00×10-3C2-1.039 93×10-4D2

表3 回归模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

模型的 F 值为 105.63，P＜0.000 1，差异极显著。通过对试验模型可信度进行分析，得到R2=0.990 6，R2adj=0.981 2，接近于1，表明响应值的变化有99.06%来自于所选因素，该方程拟合度较好。失拟项P 值为0.4585，差异不显著，说明该响应面模型所设计并进行的非正常试验误差较小，二次模型具有合理性[29]，可以用此模型来确定提取盐地碱蓬多糖的最佳工艺条件。通过因素显著性来分析模型系数，可以看出因素AC 即提取时间和提取温度的交互作用极显著，其他单因素之间交互作用显著性不明显。F 值的大小反应了各因素对于多糖得率的影响强弱，各单因素对多糖得率的影响顺序是：料液比＞提取时间＞超声功率＞提取温度。

2.2.3 响应曲面分析

各因素对盐地碱蓬茎叶多糖得率的影响及各因素之间的交互作用如图5所示。

由响应面曲线形状可以判断出各因素对盐地碱蓬茎叶中多糖得率的影响程度。响应曲面越陡峭，表明该因素对多糖得率影响越显著[30]。图5a 为提取时间、料液比的交互作用，料液比的响应曲面更加陡峭，因此料液比对多糖得率的影响较提取时间更为显著；图5b 为料液比、超声功率的交互作用，料液比的响应曲面更加陡峭，因此料液比对多糖得率的影响较超声功率更为显著；图5c 为提取时间、提取温度的交互作用，提取时间的响应曲面更加陡峭，因此提取时间对多糖得率的影响较提取温度更为显著；图5d 为料液比、提取温度的交互作用，料液比的响应曲面更加陡峭，因此料液比对多糖得率的影响较提取温度更为显著；图5e 为提取温度、超声功率的交互作用，超声功率的响应曲面更加陡峭，因此超声功率对多糖得率的影响较提取温度更为显著；图5f 为提取时间、超声功率的交互作用，提取时间的响应曲面更加陡峭，因此提取时间对多糖得率的影响较超声功率更为显著。该结论与表3方差分析相符合。响应曲面等高线图中，等高线的形状为椭圆形表示因素存在显著交互作用，圆形表示不显著[31]。图5中各组等高线均为椭圆形，说明各因素对多糖得率存在交互作用。

图5 两因素交互作用对得率的影响Fig.5 Response surface plots of variable parameters on the oil extraction rate

2.2.4 响应面设计最佳工艺条件及验证性试验

对回归方程求解，得到响应面拟合的盐地碱蓬茎叶中多糖提取工艺的最佳条件为：料液比0.51 ∶80（g/mL）、超声功率365.61 W、提取时间20.69 min、提取温度69.75℃。预测优化后的得率为10.6374%。结合仪器的现实要求，将最佳工艺参数修正为：料液比 0.51 ∶80（g/mL）、超声功率366 W、提取时间21 min、提取温度70 ℃。取3 等份盐地碱蓬茎叶原料进行平行验证试验，试验结果分别为：10.739%、10.681%、10.722%，验证试验所得平均得率10.714%，与理论预测值相比，其相对误差为0.720。结果表明，经过相应回归方程拟合出的理论值与实际值相吻合，证明响应面法可以有效的优化盐地碱蓬茎叶多糖提取工艺。

2.3 抗氧化性试验结果

2.3.1 碱蓬多糖清除羟基自由基的活性测定

图6为不同质量浓度的碱蓬多糖和VC清除羟基自由基的活性对比。VC对羟基自由基的清除率接近100%，碱蓬多糖在浓度较低时清除羟基自由基的活性很差，随浓度增大其对羟基自由基清除率迅速升高，在浓度达到2.85 mg/mL 后，羟基自由基清除率随碱蓬多糖质量浓度增加变化不再明显。碱蓬多糖浓度达5.1 mg/mL 时羟基自由基清除率最高，达到89.2%。

图6 羟基自由基清除试验Fig.6 Experimental results on the elimination of hydroxyl radicals

2.3.2 碱蓬多糖清除DPPH·的活性测定

不同质量浓度的碱蓬多糖对DPPH·的清除活性如图7所示，选择VC进行对照试验。随浓度增大碱蓬多糖对DPPH·的清除率逐渐增加，当浓度达到5.1 mg/mL时对DPPH·清除率最高，达到81.9%。

图7 DPPH·清除试验Fig.7 Experimental results on the elimination of DPPH·

2.3.3 碱蓬多糖清除O2-·的活性测定

不同质量浓度的碱蓬多糖和VC对O2-·的清除活性如图8所示，两者对O2-·的清除活性均随质量浓度的增大而增大，当浓度达到5.1 mg/mL 时两者对O2-·的清除活性均为最高，碱蓬多糖达到79.2%。虽然活性较VC低，但能够说明盐地碱蓬多糖在浓度较高时对超氧阴离子自由基的清除效果良好。

图8 超氧阴离子清除试验Fig.8 Experimental results on the elimination of O2-·

3 结论

以盐地碱蓬茎叶粉末（60 目）为原料，选择超声-微波协同法提取盐地碱蓬茎叶中多糖。在单因素试验的基础上，利用响应面法对提取工艺进行优化，得出结论如下：

响应面试验的最佳提取工艺为：料液比0.51 ∶80（g/mL）、超声功率 366 W、提取时间 21 min、提取温度70 ℃。在此优化条件下多糖得率为（10.714±0.720）%，接近响应面优化法得到的理论值。

抗氧化性能试验表明，盐地碱蓬茎叶多糖对于羟基自由基、DPPH·和O2-·均有较强的清除能力，其抗氧化活性随多糖浓度增加而增大，浓度达到5.1 mg/mL时，对羟基自由基、DPPH·和O2-·的清除率分别为89.2%、81.9%、79.2%，接近VC。说明盐地碱蓬茎叶多糖具有较强的抗氧化性能，可以作为天然抗氧化剂应用于食品、医药等行业，具有一定的开发前景和应用价值。