响应面法优化超声波辅助提取金红苹果多酚工艺研究*

郝 鑫 吕慧威 沈晓溪 孙志波 周晓梅*

1（吉林师范大学博达学院食品工程系，吉林四平136000）2（四平市科学技术研究院，吉林四平136000）

金红苹果，又称吉红苹果、“123”果，蔷薇科苹果属，是由吉林农业科学研究所于上世纪60年代用优质大苹果“金冠”和抗寒小苹果“红太平”杂交培育而成。果实汁多，酸甜爽口，营养成分丰富，素有“全方位健康水果”和“全科医生”之称。作为一种早熟品种，它产量高，品质优，抗寒力与适应性强，因此是吉林地区的主要果树栽培品种。但是随着交通运输以及电子商务的发达，使得金红苹果在鲜果市场的竞争力减弱，造成一定程度的资源浪费。

植物多酚是多羟基酚类化合物的总称，主要分布在植物体的皮、根、叶、壳和果肉中，尤其是蔬菜、水果、茶等植物，在自然界中的储量非常丰富。近年来研究人员对植物多酚的功能性进行研究，结果表明植物多酚在抗氧化、抑菌、抗癌、抗老化等方面均有显著功效，摄入一定量的植物多酚能够有效地预防和抑制疾病的发生。在日本，则有人将植物多酚称为第七类营养素。因为植物多酚有多种活性作用，使得它成为科研人员研究的热点、食品添加剂生产厂家热衷的生产原料。目前越来越多的新型萃取技术已被应用于多酚的提取，如超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法和加压液体萃取法等。其中，超声波提取法应用较广，因为超声波在工作时产生机械效应、热效应及扩散、空化效应、乳化效应、击碎效应、化学效应等，这些作用结果能够使细胞壁破碎速度增加，有效促进细胞外部溶剂进入细胞内部，使细胞中有效成分溶出，缩短作用时间，从而提高效率。

本次试验是在齐娜、王临宾、辛明亮、郭娇娇等研究的基础上，以金红小苹果为原料，利用响应面法，优化超声波辅助提取金红苹果多酚的工艺。考察了超声波功率、乙醇体积分数，提取时间、提取温度和液料比5个因素对提取效果的影响，并得到最佳提取工艺，旨在为提高金红苹果利用率方面提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜金红苹果，购自四平市某水果超市。

没食子酸标准品，98%，上海金穗生物科技有限公司；福林酚、碳酸钠、无水乙醇，均为分析纯，上海金穗生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

YP4002电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；JYL料理机，九阳股份有限公司；GZX鼓风干燥箱，济南捷岛分析仪器有限公司；GF-08高速多功能粉碎机，浙江荣浩工贸有限公司；SY-1000E多用途恒温超声提取机，上海比朗仪器制造有限公司；LXJ-B离心机，上海安亭科学仪器厂；TU-1901紫外分光光度计，北京普希仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 金红苹果预处理

将新鲜金红苹果清洗后，切块，去核，进行粗破碎，在60℃的鼓风干燥机中干燥至果肉变酥脆，期间每隔1 h调整托盘中苹果块位置，翻面调整，保证干燥均匀。将干燥好的金红苹果块研磨至粉末状，过40目筛网，密封保存备用。

1.3.3 标准曲线的制作

称取标准品（没食子酸） 1.000 g于1000 mL容量瓶中，蒸馏水溶解后定容。制得的溶液即为没食子酸标准储备液。分别移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL没食子酸标准储备液于100 mL容量瓶中并定容。取上述不同质量浓度各溶液1 mL，分别加到10 mL容量瓶中，依次各加入5.0 mL10%Folin-Ciocalteau试剂，摇匀后反应5 min～6 min，再依次加入4.0 mL7.5%碳酸钠溶液，最后用蒸馏水定容，摇匀，常温静置1 h。在760 nm处测定标准溶液的吸光度值，以没食子酸质量浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.4 金红苹果多酚含量的测定

称取5 g金红苹果粉末于250 mL三角瓶中，以乙醇溶液作为提取溶剂，在超声波辅助下提取，过滤后将滤液定容至250 mL，视为待测样液。移取1 mL待测样液于25 mL容量瓶中定容，按上述

1.3.3 方法测定吸光度，计算多酚得率。

1.3.5 多酚提取单因素试验

为了考察不同因素对金红苹果多酚提取效果的影响，选择超声功率（W）、乙醇体积分数（%）、提取时间（min）、提取温度（℃）、料液比（mL∶g）5种因素进行单因素试验。

1.3.5.1 超声波功率对提取得率的影响

在乙醇体积分数 40%，液料比 30∶1（mL∶g），提取温度55℃，提取时间30 min的条件下，超声波功率分别选择为200 W、300 W、400 W、500 W、600 W，依次考察不同超声波功率对金红苹果多酚提取得率的影响。

1.3.5.2 乙醇体积分数对提取得率的影响

在超声波功率 600 W，液料比 30∶1 （mL∶g），提取温度55℃，提取时间30 min的条件下，乙醇体积分数分别为20%、30%、40%、50%、60%，依次考察不同乙醇体积分数对金红苹果多酚提取得率的影响。

1.3.5.3 提取时间对提取得率的影响

在超声波功率600 W，乙醇体积分数40%，液料比30∶1（mL∶g），提取温度55℃条件下，超声波作用时间分别为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，依次考察不同提取时间对金红苹果多酚提取得率的影响。

1.3.5.4 提取温度对提取得率的影响

本研究根据感知价值理论的相关文献，在以前研究者采用的调查问卷基础上结合无现金支付自身的特征，归纳消费者使用无现金支付的影响因素，选择合适的变量作为问卷设计的依据，最后形成了消费者无现金支付使用意愿影响因素量表。量表的所有题项均采用Likert 5级量表，用1-5表示不同意到非常同意5个选项。

在超声波功率600 W，乙醇体积分数40%，液料比30∶1（mL∶g），提取时间30 min条件下，提取温度分别设置为35℃、45℃、55℃、65℃、75℃，依次考察不同提取温度对金红苹果多酚提取得率的影响。

1.3.5.5 液料比对提取得率的影响

在超声波功率600 W，乙醇体积分数40%，提取时间30 min，提取温度为55℃条件下，液料比分别为 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1（mL∶g），依次考察不同液料比对金红苹果多酚提取得率的影响。

1.3.6 Box-Behnken响应面法优化试验

通过单因素试验，在Design Expert8.0.6.1软件的帮助下，遵照Box-Behnken试验设计原理，选择提取时间（min） A、超声功率（W） B、乙醇体积分数（%） C、液料比（mL∶g） D 4个变量，以多酚得率为考察指标，设计响应面试验（四因素三水平）。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线及回归方程

在最大吸收波长760 nm下，测定不同质量浓度（μg/mL） 下没食子酸标准品溶液的吸光度，标准曲线图如图1所示。由图1可知，没食子酸质量浓度c（μg/mL） -吸光度标准曲线回归方程为y=10.457x+0.0373，R2=0.9991。

2.2 单因素试验

2.2.1 超声波功率对金红苹果多酚提取得率的影响

图1 没食子酸标准曲线

超声波功率（W）对多酚得率的影响如图2所示。

图2 超声功率对金红苹果多酚提取得率的影响

2.2.2 乙醇体积分数对金红苹果多酚提取得率的影响

乙醇体积分数对多酚得率的影响如图3所示。结合数据及趋势图可看出，随着乙醇体积分数的增大，多酚得率呈现先升高后降低的变化趋势，当乙醇体积分数在20%～40%范围时，得率是增大趋势，且增幅较大，体积分数为40%时，得率达到峰值，当乙醇体积分数大于40%时，得率下降明显。出现这种情况，分析原因可能是在乙醇体积分数大于40%后，醇溶性质、色素、亲脂性强的成分与乙醇溶液水分子结合，使得组织的通透性下降、体系的黏度增大，不利于目标物的浸出。因此最终选取体积分数为40%乙醇溶液作为金红苹果多酚的提取溶剂浓度。

图3 乙醇体积分数对金红苹果多酚得率的影响

2.2.3 提取时间对金红苹果多酚提取得率的影响

提取时间（min） 对多酚得率的影响如图4所示。

图4 提取时间对金红苹果多酚得率的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，多酚得率的变化分为3种不同情况，即先迅速增加，然后趋于平缓，最后呈下降的趋势。提取时间由10 min延长到20 min时，可以看出得率增大的趋势比较明显。分析原因是提取时间短，对原料细胞壁的破坏作用较小，细胞壁的破坏不彻底，这使得细胞中的多酚物质没有完全溶解在乙醇溶剂中，所以得率较低；而当提取时间延长到20 min时，细胞壁破碎较彻底，多酚物质能够较为彻底的溶出，得率也就有所提高。当继续延长提取时间时，多酚物质的得率并未有明显增加，主要原因可能是长时间的作用使得多酚物质活性下降或已被氧化。另外考虑到时间、耗能、成本等方面的因素，最终确定了超声波提取时间为30 min。

2.2.4 提取温度对金红苹果多酚提取得率的影响

提取温度（℃） 对多酚得率的影响如图5所示。由图5可知，不同温度对金红苹果中多酚得率的影响不同，随温度的升高多酚得率呈增大趋势。温度的升高，有利于超声波对细胞壁的破坏作用，有利于多酚溶出，提高得率，且温度升高有助于增大多酚的溶解度，同时多酚的热稳定性比较高，整个温度范围内，多酚得率持续增加；温度越高，耗能越大，升温时间越长，综上所述，提取温度选择中间温度55℃为宜。

图5 提取温度对金红苹果多酚得率的影响

2.2.5 液料比对金红苹果多酚提取得率的影响

液料比（mL∶g） 对多酚得率的影响如图6所示。

图6 液料比对金红苹果多酚得率的影响

由图6可知，随着液料比的增大，金红苹果多酚的得率呈现先增大，中段平稳，末段略有下降趋势。增大液料比，可使原料与溶剂的接触面增大，可增加成分溶出，提高得率。当液料比达到30∶1时，多酚得率最高，溶剂用量继续增加，得率有所下降。30∶1与35∶1的液料比得到的提取液中多酚的含量相差不明显，考虑成本及回收的情况，最终选择液料比为 30∶1。

2.3 超声波辅助提取金红苹果多酚响应面优化试验

2.3.1 响应面试验结果及回归方程的建立

在单因素试验研究的基础上，选择提取时间（A）、超声波功率（B）、乙醇体积分数（C）、液料比（D）进行四因素三水平的优化设计，响应面因素水平设计见表1，试验结果见表2。

结合对响应面优化设计得出的数据（表2） 进行分析，得金红苹果中多酚物质与超声波辅助提取各因素变量间的函数关系，所得的二次多项式方程为：Y=5.19+0.29A+0.41B+0.19C+0.95D+0.23AB-0.03AC+0.25AD+0.02BC+0.00BD+0.03CD-0.62A2-0.33B2-0.45C2-0.90D2。回归方程显著性检验结果见下页表3。

表1 超声波辅助提取金红苹果多酚响应面分析因素与水平设计

表2 超声波辅助提取金红苹果多酚响应面设计与结果

由表3可知，回归模型p＜0.0001，说明二次回归方程模型差异极显著。模型整体方差分析F＝9.202，p＜0.05，说明模型成立有统计学意义。失拟合项方差分析表明，F＝5.39，p＞0.05，失拟不显著，模型决定系数为0.902，说明响应值的变化90.2%来源于所选因素，说明模型拟合良好，试验误差较小，可以用此模型对金红苹果多酚的提取工艺进行分析并预测超声波辅助提取金红苹果多酚的最佳工艺参数。

2.3.2 响应面模型分析因子间交互作用

模型一次项B、D和二次项A2、D2高度显著，一次项A和二次项C2显著。

图7（a）-（f）为试验各因素对多酚得率影响的响应面图。其中（a）、（c）、（e）、（f）曲面相对较陡，表明超声波功率与提取时间、提取时间与液料比、超声波功率与液料比、乙醇体积分数与液料比之间的交互作用比较大，它们的作用对多酚得率有一定影响，但是不显著；（b）、（d） 曲面相对平坦，说明提取时间与乙醇体积分数、超声波功率与乙醇体积分数交互作用小，它们对多酚提取的得率影响小。从图7整体来看，液料比与其他因素的交互作用对金红苹果多酚的影响最显著。通过对回归系数检验可知，各因素对多酚得率的影响顺序为液料比＞提取时间＞超声波功率＞乙醇体积分数。

2.3.3 最佳工艺条件的确定及验证

通过Design Expert8.0.6.1对回归方程的分析，得到超声波辅助提取金红苹果多酚的最佳工艺条件为：提取时间34.98 min，超声波功率581.64 W，乙醇体积分数42.36%、液料比33.02∶1。根据以上条件，调整工艺参数为提取时间为35 min，超声波功率为580 W，乙醇体积分数为40%、液料比（mL/g） 为30∶1。根据调整后的工艺参数，进行3次重复试验，金红苹果多酚的最终得率为5.38%，此结果与预测的多酚得率5.74%接近，表明回归模型可以较好的反应金红苹果多酚提取的最佳条件。

3 结论

本试验研究金红苹果多酚的提取工艺优化，将超声波提取的方法应用到乙醇溶剂提取工艺中。首先通过单因素试验方法确定了提取金红苹果多酚物质工艺中超声功率、乙醇体积分数、提取时间、提取温度、料液比这5种因素对多酚提取得率的影响；然后应用Box-Behnken响应面法建立二次回归模型方程，对提取的工艺条件进行优化，对不同因素及因素的相互作用进行分析，得到最佳工艺条件为：提取时间35 min，超声波功率580 W，乙醇体积分数40%，液料比（mL∶g） 30∶1。此条件下金红苹果多酚的得率为5.38%。超声波辅助提取金红苹果多酚，工艺时间短，效率高，操作便捷，成本低，对金红苹果多酚的提取提供了理论依据和参考。通过文献发现，目前对于苹果多酚的提取工艺还包括微波辅助、超声波-微波结合辅助的方法，为此，将进一步考察微波作用对金红苹果多酚物质提取的影响。

表3 超声波辅助提取金红苹果多酚回归方程的方差分析

图7 试验各因素对多酚得率影响的响应面图