5种常见加工肉制品的DNA提取方法比较以及猪源性成分检测

李 晶 杨 成

（江南大学食品学院，江苏无锡 214122）

近年来，越来越多的肉类食品安全问题被曝出：欧洲的“马肉事件”、中国的“假羊肉”事件以及肉产品加工黑作坊的“冒充”事件等，因此，消费者对肉及其加工制品掺杂造假现象的关注度也呈逐年增加趋势。如何判断肉及其加工食品标签的真实性，成为越来越多研究者研究的焦点。目前，对于动物源性成分的鉴定主要集中在基于DNA的检测方法上，因此，所提基因组DNA质量的高低、质量浓度的大小直接关系到检测鉴定的效果。尽管已经报道的DNA提取方法有很多，但由于食品样品基质复杂、加工方式多样，针对不同的食品肉产品样品，不同的DNA提取方法必然会对DNA提取效果产生较大的影响。因此，本研究以5种常见的市售加工肉制品样品（蚝油牛肉片、鸡肉火腿肠、牛肉火腿肠、猪肉馅、猪肉脯）为试验材料，以十二烷基磺酸钠（SDS） 法、十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法、浓盐法、ROCHE试剂盒法以及TIANGEN试剂盒法为试验方法，优选出针对这5种常见加工肉制品的高效、快速、简便、经济的DNA提取方法，并用所提取的DNA样品进行实时聚合酶链式反应（PCR）试验，以验证它们标签的真实性，旨在为后续的分子生物学的相关研究奠定基础，对食品安全领域的研究具有一定的指导意义。

1 材料与设备

1.1 试验材料

蚝油牛肉片（标签已注明不含猪肉成分）、鸡肉火腿肠、牛肉火腿肠（标签已注明不含猪肉成分）、猪肉馅、猪肉脯，购于无锡市欧尚超市（高浪路店）。

1.2 主要试剂及设备

三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、异丙醇、乙酸钾、Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、十六烷基三甲基溴化铵、盐酸、氢氧化钠、蛋白酶K等，分子生物学级，阿拉丁化学试剂公司；ROCHE试剂盒（Cat.No.11796828001），罗氏集团化学试剂公司；TIANGEN试剂盒（DP304），天根生物（北京） 公司；琼脂糖N，生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR试剂盒（Code No.RR912），宝生物工程（大连）有限公司。

UV-3600 PLUS型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；BSA 124S型电子天平，赛多利斯公司；DYY-8C型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；Light Cycler 96型基因扩增仪，罗氏公司；KQ-100DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；5810R型低温高速离心机，德国艾本德公司；Biorad GelDoc XR+凝胶成像分析系统，美国伯乐仪器公司；涡旋振荡器，德国艾卡公司。

2 试验方法

2.1 样品预处理

分别称取一定量的肉制品样品，用不锈钢多功能绞肉机将样品尽可能充分绞碎，分装，备用。

2.2 DNA提取方法

2.2.1 氯化钠法提取DNA

在参考文献[9]并加以改进。称取200 mg经过处理的样品，加入400 μL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mMEDTA，pH 8.0），然后置于涡旋振荡器上充分振荡30 s，至彻底悬浮；在上述混合样品中加入8 mL lysis缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0；2 mM EDTA，pH 8.0；0.4 M NaCl）和800 μL 20%的SDS，再次置于涡旋振荡器上彻底混匀。其余步骤同参考文献（操作过程中相应增加试剂及溶剂用量）。

2.2.2 SDS法提取DNA

考农业部2406号公告《转基因动物及其产品成分检测DNA提取和纯化》。

2.2.3 CTAB法提取DNA

参考文献[10]并加以改进。称取200 mg经过处理的样品，加入400 μL娃哈哈矿泉水和1 mL CTAB提取缓冲液（20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 MTris-HCl，20 mMNa2EDTA），然后置于涡旋振荡器上充分振荡至彻底悬浮。其余步骤同参考文献（操作过程中相应增加试剂及溶剂用量）。

2.2.4 ROCHE试剂盒法提取DNA

参照ROCHE试剂盒的操作说明进行试验。

2.2.5 TIANGEN试剂盒法提取DNA

参照TIANGEN试剂盒的操作说明进行试验。

2.3 DNA浓度和纯度的测定

吸取一定量的DNA样液，加入一定体积的TE缓冲液稀释，混匀，转入分光光度计的石英比色杯中，用等体积的TE缓冲液作对照，置于紫外分光光度计上测定DNA样液在260 nm处、230 nm处、280 nm处的吸光度值，DNA质量浓度的计算公式为：DNA质量浓度（ng/μL）＝A260×50×稀释倍数。

根据260 nm处的吸光度值计算所得DNA的质量浓度，根据A260/A280和A260/A230的值判断所提基因组DNA的纯度。一般来说，A260/A280在1.8左右，A260/A230大于2.0即可判定所提基因组DNA的纯度较高。

2.4 实时PCR技术检测猪源性成分

参考《SN/T 2051—2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》。实时PCR体系为：2×Premix for Porcine 12.5 μL，Primer Mix for Porcine 1 μL，Probe Mix for Porcine 1 μL，样品DNA1 μL，加双蒸水至25 μL。两步法PCR扩增标准程序：95℃预变性10 s；95℃变性5 s，60℃延伸30 s，40个循环。为确保检测结果的准确性，防止出现假阴性和假阳性的检测结果，需先进行空白对照试验和阳性对照试验。

3 结果与讨论

3.1 紫外分光光度计检测结果

5种提取方法对5种常见加工肉制品基因组DNA提取效果的比较结果见表1。

由表1可知，对于不同加工方式的肉制品，它们基因组DNA的最佳提取方法并不完全相同。但通过分析可知，采用CTAB法提取这5种加工肉制品的DNA，均能获得最佳得率和质量浓度，范围分别是 156.0±4.8 μg/g～196.0±6.2 μg/g 和 312.0±9.7 ng/μL ～392.0±12.4 ng/μL；同时，所得 DNA 的纯度也相对较高，A260/A280基本在1.8左右，A260/A230基本在2.1左右。其次，氯化钠法对猪肉脯、猪肉馅、鸡肉火腿肠以及蚝油牛肉片的提取效果较好，也可以作为一种肉制品DNA提取的备选方法。

3.2 实时PCR技术检测食品样品的猪源性成分

为确保检测结果的准确性，首先进行了空白对照试验和阳性对照试验，检测结果均显示正常，因此可以进行后续的实际样品检测。将CTAB法提取所得的基因组DNA进行实时PCR试验，结果如图1所示。猪肉脯（图1A）、鸡肉火腿肠（图1B） 和猪肉馅（图1C） 的实时PCR检测结果可以看出，HEX信号和FAM信号均显示阳性，因此判定它们均含有猪源性成分，这一检测结果也与它们的标签相吻合；牛肉火腿肠（标签已注明不含猪肉成分）（图1D） 和蚝油牛肉片（标签已注明不含猪肉成分） （图1E） 的实时PCR检测结果均显示只有HEX信号检出而无FAM信号检出，因此判定它们都不含有猪源性成分，同样地，这一检测结果也与它们的标签相吻合。如表2所示，通过5种加工肉制品的实时PCR检测的Ct值也可以很直观的看出牛肉火腿肠和蚝油牛肉片不含猪源性成分。因此，就是否含有猪源性成分这一点来说，它们的标签均真实可靠。同时，该试验结果也表明，CTAB法提取的基因组DNA可以满足实时PCR试验的要求。

表1 5种DNA提取方法对5种常见加工肉制品提取效果的比较

表2 5种加工肉制品实时PCR荧光信号Ct值

4 结 论

综上所述，CTAB法提取所得的基因组DNA无论从浓度、得率还是纯度来看，都明显高于其他4种方法，同时，CTAB法提取的DNA能达到PCR试验的要求，是较佳的加工肉制品的DNA提取方法；浓盐法提取所得基因组DNA的质量仅次于CTAB法，也可以作为加工肉制品基因组DNA提取的备选方法之一；SDS法提取所得基因组DNA的浓度和纯度相对试剂盒法较高，但是得率较低；ROCHE试剂盒法和TIANGEN试剂盒法操作简便、快速，但提取所得基因组DNA的浓度和得率明显小于其他3种方法，并且价格昂贵，增加试验成本。同时，PCR试验表明，这5种加工肉制品的食品标签均符合其真实属性。