鸡白痢沙门菌减毒候选疫苗株的环境应激评价及主要生物学特性测定

王艳琳，满成连，冯 政，陈素娟，秦 涛，彭大新

(扬州大学兽医学院，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心/江苏省家禽疫病防控工程技术研究中心，江苏扬州225000)

鸡白痢沙门菌(Salmonella enterica serovar Pullorum)可以通过水平传播和垂直传播而引起雏鸡的鸡白痢，造成较高的发病率和死亡率[1-3]。该病在我国鸡群中分布较广，其也是《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》确定的优先防治病种。由于抗生素的使用会导致细菌的耐药性增加，疫苗免疫成为净化该病的重要手段。减毒疫苗较灭活疫苗而言，不仅能够刺激机体产生体液免疫应答，而且还能产生细胞免疫和黏膜免疫应答。因此，研制鸡白痢沙门菌减毒疫苗成为近年来国内外的研究热点。生物被膜(Biofilm)是细菌在生长过程中附着在物体表面形成的膜样复合物[4]，可以增强细菌对外界环境的耐受力。卷曲菌毛是生物被膜的主要成分之一，其结构亚基csgA由操纵子csgBAC合成，缺失后会影响生物被膜形成[5]。ompR基因是EnvZ/OmpR双组分调节系统中的应答调节剂，缺失该基因后的细菌不能分泌外膜蛋白OmpF，影响菌体对环境的适应力[6]，其也可以与CsgD启动子结合间接影响细菌生物被膜的形成。

本实验室前期基于λ-Red同源重组系统在S6702△rfaG和S6702△rfaL单基因缺失株基础上构建了一系列鸡白痢沙门菌双基因缺失株S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA和三基因缺失株、S6702△rfaG△csgA△ompR、 S6702△rfaL△csgA△ompR，免疫效力试验结果显示这些缺失株均具有较好的免疫保护作用和体内安全性[7]。但由于活菌会随动物体向环境外排放，对生物安全造成潜在的风险，因此开展减毒候选疫苗株的生物安全评价不可或缺。因此本研究对上述缺失株开展了生物被膜形成能力测定、酸碱、温度、紫外线环境应激试验、药敏试验及两种消毒剂灭活效果试验，判定各菌株在不同环境中的生存能力，为疫苗侯选株的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌 株 鸡白痢沙门菌野生菌株S6702由本实验室分离并保存，鸡白痢沙门菌基因缺失株S6702△rfaG、S6702△rfaL、S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA、S6702△rfaG△csgA△ompR、S6702△rfaL△csgA△ompR由本实验室构建。肠炎沙门氏菌活疫苗Sm24由罗曼公司生产。

1.2 主要试剂 DL2000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；结晶紫(Crystal Violet)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；胰酪胨大豆肉汤培养基TSB购自Fluka公司；麦康凯琼脂培养基、氯化钠、纯化琼脂粉等均购自国药集团；卫可过硫酸氢钾复合物粉由英国安德国际有限公司生产；中牧金碘聚维酮碘溶液由中牧南京动物药业有限公司生产。

1.3 生长曲线的测定 将野生沙门菌S6702、单基因缺失株S6702△rfaG、S6702△rfaL、双基因缺失株S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA以及三基因缺失株 S6702△rfaG△csgA△ompR和 S6702△rfaL△csgA△ompR于37℃，220 r/min振荡培养，每隔1.5 h检测一次培养物的OD600nm值，连续测定8次，共计12 h，重复3次试验，最后将所得数据利用GraphPad prism软件绘制细菌的生长曲线。

1.4 沙门菌生物被膜形成的检测 参照Pratt等方法[8]，挑取野生沙门菌S6702及6株基因缺失株的单个菌落分别接种于TSB培养基中，37℃、220 r/min过夜震荡培养，利用1∶10 TSB培养基以1∶100比例稀释各菌液后接种于96孔U型细胞培养板，对照组接种100 μL无菌1∶10 TSB培养基，置28℃静置培养72 h后，取出培养板，弃菌液，利用结晶紫溶液每孔100 μL避光染色20 min，在培养板底部形成生物被膜环，倒出培养板内液体，超纯水洗涤3遍，利用乙醇丙酮溶液溶解沉积于培养板底部的生物被膜环，利用酶标仪测定各菌的OD550nm值。每次试验重复2个孔，试验重复3次取其平均值。

1.5 环境应激试验 将野生菌株S6702、肠炎沙门菌疫苗菌株Sm24与6株基因缺失株在LB平板于37℃静置培养24 h后挑取若干单菌落全板均匀划线于LB琼脂平板上，37℃静置培养至对数生长期(约6 h)，用含15%甘油的PBS将LB平板上的细菌全部刮下，放置于指形管中，12 000 r/min离心10 min，再用15%甘油PBS洗涤2～3次，调节菌液OD600nm=0.4，作为后期试验的初始菌液。

参照Han等[9]方法，取 100 μL OD600nm=0.4的各菌株菌液顺次加入900 μL pH分别为7.2、6.0、5.0和4.0的LB肉汤和pH为7.2和8.0的Tris-Cl中，置于37℃震摇培养30 min作为实验组，以各菌株在pH为7.2的LB(中性LB)肉汤培养基培养做为对照组，检测各菌株对酸碱的耐受能力。

选取OD600nm=0.4的各菌株菌液100 μL分别置于900 μL的pH为7.2的LB肉汤培养基中，54℃震摇培养3 min作为实验组，将相应菌株置于37℃震摇培养3 min作为对照组，检测各菌株对高温的耐受能力。

选取OD600nm=0.4的菌液1 mL置于9 mL的pH为7.2的LB肉汤培养基中，并均匀散布于无菌培养皿中，置于紫外灯下25 cm处分别照射2 min和5 min作为实验组，将各相应菌株菌液开盖置于白炽灯25 cm处处理5 min作为对照组，

经不同环境处理后的菌液离心后收集菌体，使用15%甘油PBS洗涤并重悬，10倍倍比稀释后涂布于麦康凯平板，培养18 h后菌落计数。每组试验重复3次取平均值。

1.6 药敏试验 采用纸片琼脂扩散K-B法[10]检测鸡白痢沙门菌野生菌株S6702、6株基因缺失株和肠炎沙门氏菌活疫苗株Sm24对7种常见药物的敏感性试验。根据美国临床实验室标准委员会(CLSI/NCCLS)2005年标准，肠杆菌科耐药抑菌圈直径判定标准为诺氟沙星、庆大霉素、氯霉素≤12 mm；卡那霉素、萘啶酸≤13 mm；四环素≤14 mm、环丙沙星≤15 mm。

1.7 消毒剂灭活效果试验 初始菌液的准备同1.5，卫可过硫酸氢钾粉剂根据参考使用说明按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400 配置，商品化聚维酮碘溶液稀释至浓度为0.1%和0.01%。参照Guo等试验方法[11]，分别取野生菌株S6702、肠炎沙门菌疫苗株Sm24与6株基因缺失株OD600nm为0.4的各菌株菌液各100 μL置于900 μL的上述不同浓度的各消毒剂溶液中，于37℃震荡培养5 min，立即离心收集菌体，经15%甘油PBS洗涤并重悬，10倍倍比稀释后涂布于麦康凯平板，培养18 h后菌落计数。每组试验重复3次取平均值。

1.8 实验数据的处理 各试验数据利用Graphpad prism软件绘制图像并经SPSS软件进行显著性差异分析。

2 结果

2.1 各菌株生长曲线的测定结果 同时对野生菌株S6702及6株基因缺失株进行生长曲线的测定。结果显示，与野生菌株S6702相比，所有的基因缺失株的生长速度均未出现显著变化(p＞0.05)，且基因缺失株的生长曲线具有明显的对数生长期(图1)，表明rfaL、csgA和rfaG基因的缺失不影响细菌的生长能力，可以满足疫苗株的研制需要。

2.2 各菌株生物被膜形成能力的测定结果 在96孔板中以结晶紫染色定量法测定各菌株的生物被膜形成能力。结果显示单基因缺失株S6702△rfaG、S6702△rfaL的OD550nm与野生菌株S6702相比稍有降低，但无显著差异(p＞0.05)，而双基因缺失株S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA和三基因缺失株S6702△rfaG△csgA△ompR、S6702△rfaL△csgA△ompR的生物被膜形成能力较野生菌株S6702则显著降低(p＜0.01)(图2)。结果表明，缺失生物被膜相关基因csgA或/和ompR后鸡白痢沙门菌丧失了生物被膜的形成能力。

2.3 各菌株对环境应激的试验结果 对各菌株进行酸耐受试验，结果显示当LB培养基的pH=6.0时，三基因缺失株S6702△rfaG△csgA△ompR和S6702△rfaL△csgA△ompR的存活率较在pH=7.2的中性LB中的存活率有所降低，其余基因缺失株和野生菌株的存活率与在中性LB培养基中相比有所上升；当LB培养基的pH=5.0时，疫苗株Sm24和单基因缺失株S6702△rfaG的存活率与在中性LB培养基中相比无显著差异(p＞0.05)，其余菌株的存活率均开始下降；当LB培养基的pH为4.0时，所有被测菌的存活率均开始显著下降(p＜0.01)，其中基因缺失株的存活率较野生菌株S6702和疫苗株Sm24的更低(p＜0.001)(图 3A)。

碱耐受试验中，与pH=7.2的中性LB对照组和pH=7.2的Tris-Cl中相比较，各菌株的存活率在pH为8.0的Tris-Cl中时均呈现指数下降趋势。疫苗株Sm24和6株基因缺失株的存活率较野生菌株S6702更低(p＜0.001)(图3B)。表明，双基因缺失株和三基因缺失株均对pH=4.0的酸性培养条件和pH=8.0的碱性培养条件较野生菌株更敏感，且呈现出了微耐酸和不耐碱的生物学特性。

54℃处理3 min后的各菌存活率变化结果显示，疫苗株Sm24的存活率为其37℃对照组的48.2%，野生菌株S6702及各基因缺失菌株的存活率为各自对照组的19%～38.2%(图3C)，各实验组与37℃对照组各菌株存活率均差异显著(p＜0.01)，表明各菌株的生长在54℃条件下均能够被有效抑制。

紫外应激试验结果显示各菌株在紫外线照射后存活率较对照组均显著降低(p＜0.01)。紫外线照射2 min后各菌株存活率为各自对照组的33.7%～69.5%，紫外照射5 min后各菌株存活率为各自对照组的17.9%～35.2%(图3D)，各菌株存活率随着紫外线照射时间的延长而下降，表明生产实践中利用紫外线照射灭活环境中残留活菌的方案是可行的。

2.4 各菌株的药敏试验结果 为评估基因缺失突变对鸡沙门氏菌耐药性的影响，选择了7种抗生素对该菌野生菌株S6702、6株基因缺失株及肠炎沙门氏菌疫苗株Sm24的耐药性进行测定。结果显示，各菌株对7种抗生素的敏感性均较高，野生菌株S6702与其基因缺失株之间耐药性相似(表1)，表明各基因缺失并未改变鸡白痢沙门菌的耐药性。

2.5 消毒剂对各菌株灭活效果的检测结果 过硫酸氢钾复合物粉剂的消毒效果显示，其对野生菌株S6702的有效灭活浓度为1:50，对单基因缺失株的有效灭活浓度为1∶100，对多基因缺失株的有效灭活浓度为1∶200，对疫苗株Sm24的灭活浓度为1∶400(图4A)。聚维酮碘溶液的消毒效果显示，0.1%的稀释浓度即可灭活测定的所有菌株(图4B)。表明，两种不同成分的消毒剂均能够灭活被测菌株，但缺失生物被膜形成能力的双基因缺失和三基因缺失株对过硫酸氢钾的敏感性更高，生物安全性更好。

3 讨论

目前我国养禽业的养殖形式多样，养殖规模参差不齐，生物安全体系尚不健全，导致沙门菌的污染较为严重，而鸡白痢沙门菌垂直传播等生物学特性使得鸡白痢的防控更为困难。截至目前，成熟的商品化鸡白痢疫苗尚未出现。脂多糖(Lipopolysac-charides，LPS)是合成沙门菌等革兰氏阴性菌外膜的重要成分，也是细菌发挥毒力的重要因子。吴白等通过同源重组方法构建的LPS相关基因缺失株S6702△rfaL和S6702△rfaG不仅毒力降低，免疫原性高，而且具有DIVA(Differentiation of infected and vaccinated animals)特性[12]。本实验室前期在该基因缺失株基础上构建的csgA和/或ompR基因缺失株均失去生物被膜形成能力，在毒力降低的基础上对环境适应的能力下降，其具备更好的生物安全性。本实验通过生长曲线的测定结果显示，双基因缺失株在普通LB培养基中的生长速度与野生菌株相似，三基因缺失株生长速度略慢于野生菌株，但基因缺失株均可以满足制备疫苗所需的剂量。

表1 野生菌株和缺失株的药敏试验结果

环境应激试验结果显示，沙门菌在酸碱耐受试验中表现出了微耐酸和不耐碱的特性，这可能与鸡白痢沙门菌的感染途径相关。消化道是沙门菌侵入机体的主要感染途径，为抵抗胃酸环境，沙门菌能够激活自身的酸耐受应答反应(Acid tolerance response，ATR)[13]。本实验结果也显示培养基的pH为8.0时，各沙门菌活菌数已呈指数下降的趋势。在热应激和紫外耐受试验中，各菌株的增殖能力均能够被有效抑制。各方面环境应激结果均显示，生物被膜合成相关基因ompR和/或csgA缺失菌株的环境适应力下降，在环境中更易被灭活，具备更高的生物安全特性。

喹诺酮类药物曾广泛应用到家禽沙门菌感染的治疗，但近年来，由于不合理的使用导致了细菌耐药性的产生。沈欣悦等对2013年华东地区分离的禽源沙门菌耐药分析结果显示，高达90%的分离株均对喹诺酮类抗菌药之一的萘啶酸有抗性[14]。本研究选择的7种药物分别来自喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类和酰胺醇类，试验结果显示基因缺失株对萘啶酸和选择的其它药物均高度敏感，与野生菌株是一致的，并未因基因的缺失而改变菌株的耐药性。

综上所述，鸡白痢沙门菌基因缺失株S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA、S6702△rfaG△csgA△ompR和 S6702△rfaL△csgA△ompR均丧失了生物被膜形成能力，对环境的适应能力下降，在酸、碱、54℃热处理、紫外照射条件下均易被灭活，对两种常用消毒剂聚维酮碘和过硫酸氢钾也显示出了较高的敏感性，具有良好的环境安全性，可以作为鸡白痢沙门菌减毒候选疫苗株的潜力。