紫薯酒酿造工艺优化及挥发性香味成分分析

袁杰彬，孙 琳，李 茂

（宜宾五粮液股份有限公司技术研究中心，四川宜宾644000）

紫薯是一种富含花青素的薯类新品种，除含有普通甘薯所具有的营养物质以外，还富含紫薯花青素（PSPAs），已有研究证实紫薯花青素具有消炎[1]、抗氧化生物活性[2]、抗突变[3]、对肝损伤提供保护[4]、抗动脉粥样硬化[5]等益处。以紫薯为原料，参照果酒酿造工艺开发的紫薯酒饮料新品，具有良好的色泽和薯香，有别于传统的调配酒饮料，不仅保留了绝大部分紫薯营养物质，还保留了紫薯中的花青素。发酵是紫薯酒生产过程中的重要环节，直接影响后期成品酒的品质，本研究采用Box-Behnken响应面法对紫薯酒发酵条件进行优化，找出最佳发酵条件，同时对紫薯酒的香气成分进行研究，采用顶空固相微萃取法提取富集紫薯酒的香气成分物质，再运用GC-MS联用法对紫薯酒中香气组分进行测定和分析，尽可能详细表达出紫薯酒的香味特征。为进一步提高紫薯酒品质做好基础研究，促进紫薯产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料

紫薯：产地四川宜宾。

试剂及耗材：柠檬酸、碳酸钙，国产分析纯；α-淀粉酶、糖化酶，无锡赛德生物工程有限公司；安琪高活性酿酒干酵母；矢车菊素标品，纯度＞98%，成都曼思特生物科技有限公司；高速冷冻离心机，德国eppendorf；安捷伦7890气相色谱仪质谱仪联用；紫外可见分光光度计，国产754型；酒精计、糖度计，成都科普达科技有限公司；恒温培养箱，上海一恒科技有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 紫薯汁制备

紫薯蒸煮熟透，去皮切块后按照料液比为1∶2加水（含0.01%柠檬酸）打浆，经α-淀粉酶液化，糖化酶糖化后过滤取汁，冷藏备用。

1.2.2 发酵条件

1.2.2.1 单因素实验设计

温度对紫薯酒发酵影响：调整发酵液起始糖度为20 °Bx，pH4.0，接菌量为3.0‰，分别于16 ℃、20℃、24℃、26℃、28℃、32℃发酵7 d，测定酒精度及花青素含量。

pH值对紫薯酒发酵影响：初始糖度调整为20°Bx，分别调发酵液pH3.5、pH4、pH4.5、pH5、pH5.5，接菌量均为3.0‰，于26℃发酵7 d，测定酒精度及花青素含量。

初始糖度对紫薯酒发酵影响：发酵液pH4.0，分别调整糖度为16 °Bx、18 °Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26°Bx，接菌量均为1.5‰，于26℃发酵7 d，测定酒精度及花青素含量。

接菌量对紫薯酒发酵影响：发酵液初始糖度均调整为20°Bx，pH4.0，调整接菌量依次为0.5‰、1‰、1.5‰、2‰、2.5‰，26℃发酵7 d，测定酒精度及花青素含量。

1.2.2.2 响应面实验设计

根据单因素实验结果，采用4因素3水平的Box-Behnken响应面设计方法进行试验，见表1，以酒精含量和花青素含量为响应值，优化发酵条件。

表1 响应面实验因素水平编码表

1.2.3 紫薯酒香气成分测定

取8 mL紫薯酒于20 mL萃取瓶中，加入1.0 g氯化钠，48℃吸附平衡30 min。吸附结束后将吸附有目标物质的萃取头插入进样口，解析6 min。用相同方法处理其余待测酒样。

色谱分析条件：选择不分流模式，程序升温：35℃保持5 min，以10℃/min升至100℃，保持3 min，以15℃/min升至230℃，保持5 min。载气为高纯度氦气，流量为1 mL/min，进样口温度和检测器及各接口温度均设定为250℃。

质谱分析条件：电力方式为EI,电压70 eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，扫描范围30～800 u。

1.2.4 指标测定

1.2.4.1 酒精度

参照GB/T 15038—2006测定。

1.2.4.2 花青素含量[7]

将紫薯酒于12000 r/min离心5 min，取上清液，以水为空白，将稀释后的酒液于530 nm处测定吸光度，3次测定值求平均值。原酒中花青素含量的（μg/mL）计算公式：

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 温度对紫薯酒发酵影响

温度对紫薯酒发酵的影响如图1所示，随着发酵温度的逐步升高，紫薯酒中花青素含量在一定温度范围内较为稳定，超过24℃，花青素含量呈下降趋势；酒精含量随着温度的升高而逐渐增加，当温度达到22℃时酒精含量最高，进一步升高温度，加快了酵母生长老化速度，酒精度及花青素含量均降低。综合考虑两种评价指标选择发酵温度，确定20℃、22℃、24℃为紫薯酒的响应面优化设计对应温度因素水平，以确定最佳发酵温度。

图1 温度对紫薯酒发酵的影响

2.1.2 pH值对紫薯酒发酵影响

pH值对紫薯酒发酵的影响见图2。由图2可知，随着发酵起始pH值逐步提高，花青素含量逐渐降低，酒精度在pH3.5～4.5区间有一明显顶点值，最大酒精含量为12.8%vol，之后酒精度逐渐下降。综合考虑两种评价指标选取发酵液初始pH最佳值，确定初始pH3.5、pH4、pH4.5为紫薯酒的响应面优化设计对应因素水平，以确定最佳初始pH值。

图2 pH值对紫薯酒发酵的影响

2.1.3 初始糖度对紫薯酒发酵影响

初始糖度对紫薯酒发酵的影响结果如图3所示，随着糖度的逐步提高，酒精度也随之呈上升趋势；糖度在16～22°Bx之间，花青素含量趋于稳定，含量变化不明显，但当糖度大于22°Bx后，花青素含量明显降低。综合考虑两种指标，选取初始糖度20 °Bx、21 °Bx、22 °Bx作为紫薯酒发酵条件响应面分析对应因素水平，以确定最佳发酵条件。

图3 初始糖度对紫薯酒发酵的影响

2.1.4 接种量对紫薯酒发酵影响

酵母接种量对紫薯酒发酵的影响如图4，实验结果表明，接种量介于0.25‰～1‰之间时存在顶点值，当接种量为0.5‰时，酒精度与花青素含量均达到最大，之后逐步下降，随着接种量逐步增大，花青素含量基本趋于稳定，但酒精度下降趋势较为明显。综合考虑两种指标，选取接种量0.3‰、0.5‰、0.7‰作为紫薯酒发酵条件响应面分析对应因素水平，以确定最佳发酵条件。

图4 接种量对紫薯酒发酵的影响

2.2 响应面法优化发酵条件

2.2.1 响应面设计及结果

利用Design-Expert 8.0.6软件中BBD方法进行实验设计，共需安排27组试验，并分别以各组原酒的酒精度和花青素含量作为双响应值。结果如表2。

2.2.2 回归模型的建立及分析

2.2.2.1 模型建立

根据表3中实验结果进行多元回归方程拟合，并分别以酒精度（R1）和花青素含量（R2）为响应结果建立数学回归模型：

表2 响应面优化试验设计及结果

2.2.2.2 回归分析

由表3可知，模型的P=0.0006＜0.01，说明所构建的模型方程（Ⅰ）为极显著；模型失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，由模型Ⅰ失拟项p=0.5909＞0.05为极不显著；模型决定系数R2=0.8971，校正决定系数R2（Adj）=0.8771，说明该模型与实际拟合度较高，响应值的87.7%是由于所选变量引起；模型的离散系数CV值反映了实验的精度水平，该值越小，精度越高。当花青素含量为响应时实验结果C.V=2.67%，表明试验操作可信度较好。证明所构建回归方程模型能很好地预测和分析对应的紫薯酒原酒酒精度。

模型回归方程系数显著性分析结果见表4，可知模型方程（Ⅰ）中除一次项B、D和二次交互项AD、BC为不显著外，其余各项均对酒精度的影响达显著水平。其中二次交互项BD，各二次项均为极显著，一次项A、C，交互项AB、AC、CD均为显著水平。通过比较各一次项系数绝对值，可知各因素对紫薯酒酒精度含量影响的强弱关系：初始糖度＞温度＞初始pH值＞接种量。

由表4可知，模型的P=0.0003＜0.01，说明所构建的模型方程（Ⅱ）为极显著；模型失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，由模型失拟项p=0.8435＞0.05可知不显著；模型决定系数R2=0.9082，校正决定系数R2（Adj）=0.851，说明模型与实际拟合度较高，响应值的85.1%是由于所选变量引起；模型的离散系数CV值反映了实验的精度水平，该值越小，精度越高。当花青素含量为响应时实验结果C.V=7.79%，在可接受范围内，试验操作可信度较好。证明所构建回归方程模型能很好地预测和分析对应的紫薯原酒中花青素含量。

表3 方差分析结果(R值为酒精度)

表4 方差分析结果(R值为花青素含量)

对模型回归方程系数显著性分析结果见表4，可知模型方程（Ⅱ）中除一次项B和二次交互项AB、BC、BD、CD为不显著外，其余各项均对花青素含量的影响达显著水平。其中一次项A、C，交互项AC及二次项A、B、C、D均为极显著；一次项D、交互项AD均为显著水平。通过比较各一次项系数的绝对值，可知各因素对紫薯酒中花青素含量影响的强弱关系：温度＞初始糖度＞接种量＞初始pH值，其中温度对花青素的稳定性、初始糖度、接种量均影响显著，考虑到花青素在酸性环境中较稳定[11]，在本实验中pH值范围均为酸性，因此实验中pH值变化对花青素稳定性影响表现出不显著。

2.2.3 交互作用分析

通过对表3、表4方差分析结果，对各因素间的交互作用对紫薯酒发酵的影响显著的交互项进行响应面及等高线图分析。结果见图5—图10。

图5 初始pH值与温度对酒精度的影响

图6 初始糖度与温度对酒精度的影响

图7 接种量与初始糖度对酒精度的影响

图8 接种量与初始pH值对酒精度的影响

图9 接种量与温度对花青素含量的影响

图10 初始糖度与温度对花青素含量的影响

2.2.4 验证实验

通过软件对实验数据进行优化，得到最佳紫薯酒发酵工艺参数为：温度21.47℃，初始pH3.89，初始糖度20.63°Bx，酵母接种量0.55‰，所得紫薯酒原液中所含花青素含量为19.86 μg/mL，酒精度为13.46%vol。为对响应面优化法所得的实验条件数据进行可行性检验。根据实际条件进行发酵试验，选取试验参数为温度21.5℃，初始pH4.0，初始糖度21°Bx，酵母接种量0.55‰。选取3次平行实验，最终得到紫薯酒原酒花青素含量为19.52 μg/mL，酒精度为13.2%vol。与预测值对应误差分别为1.71%、1.93%。验证了所建模型能较准确地预测实验结果，再次证明基于响应面优化紫薯酒发酵模型的可靠性。

2.3 紫薯酒香气成分分析[12-17]

如图11所示，通过GC-MS对紫薯酒中所含挥发性香气检测，利用NIST图谱库进行检索，紫薯酒中共检测到约40种挥发性香气成分（表5），约占95%检测图谱中总峰面积，根据结构性质不同可以分为醇类、醛类、醚类、酚类、酯类、酮类及烷烃类物质。其中醇类包括丙醇、丁醇、异戊醇、异丁醇、正己醇、顺-3-己烯醇、3-甲氧基苯甲醇、芳樟醇、α-松油醇、4-萜烯醇、萜品醇、苯乙醇；酯类包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、丁酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯、亚油酸乙酯、十八碳-6,9-二烯酸乙酯；酚类物质包括4-甲基愈创木酚、2,6-二叔丁基对甲酚、对乙基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚；酮类物质包括3-羟基-2-丁酮、2-吡咯烷酮、吡喃-4-酮、α-吡喃酮、紫罗兰酮；醚类物质有乙基叔丁基醚、仲丁基醚、乙基丁基醚。其中含量较高的物质有乙酸乙酯、异戊醇、乳酸乙酯、琥珀酸二乙酯、萜品醇、苯乙醇。

图11 紫薯酒香气成分GC-MS分析总离子流色谱图

3 结论

本实验利用响应面法优化紫薯酒的发酵工艺参数，经验证优化后的工艺参数为：温度21.5℃，初始pH4.0，初始糖度21°Bx，酵母接种量0.55‰。此条件下所得紫薯发酵原酒酒精度数和花青素含量分别为13.2%vol和199.52 μg/mL。紫薯酒的香气是由许多呈香呈味物质组分间共同作用构成，香气成分作为紫薯酒重要品质指标，其挥发性物质种类与含量直接体现出酒体的品质特征，为后期进一步提升紫薯酒品质提供重要参考。

表5 紫薯酒主要香味物质