茶用荔枝产香菌的筛选与鉴定

玉 云，尹团章，庞登红，马煜明，朱 雯，黄友谊

(1.华中农业大学 园艺林学学院，湖北 武汉 430070； 2.湖北中烟工业有限责任公司，湖北 武汉 430040)

产香菌在大自然中分布广泛，种类丰富，其中，有关产香酵母的研究与应用较多。产香酵母能产生花香、果香和清香3种香型[1-4]，合成的芳香物质涉及10大类芳香物质中的30多种，而不同来源的产香酵母因其代谢不同，产生的芳香物质也不尽相同[5-8]。因此，挑选合适的材料筛选产香酵母，对发掘特色产香酵母意义重大。已有研究表明，产香酵母主要筛选自土壤、植物组织以及酒、醋、酱油等发酵食品，其中，关于发酵食品中分离筛选到的产香酵母的研究最多。关于植物组织中分离筛选的产香酵母的研究最少，但所筛选的产香酵母最具特色[9-11]。高健等[12]从莴苣中分离出1株内生酵母菌，其发酵液香气成分中柠檬烯含量高达20%，这在产香微生物中极少见。贾蓓蕾等[13]从烟草中分离出1株高降解α-胡萝卜素菌株ULI3，其主要降解产物是5，6-环氧-β-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯等香味物质。新鲜荔枝香味独特，然而，鲜有筛选产香菌用于茶叶发酵的报道。鉴于此，以荔枝果肉为材料，从中筛选适宜茶叶发酵的产香酵母菌，以促进特色发酵茶产品的开发利用。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料与试剂 荔枝购自华中农业大学水果市场，绿茶购自湖北洞庄茶叶有限公司。葡萄糖、琼脂等试剂购自国药集团化学试剂有限公司，均为化学纯。

1.1.2 主要培养基 PDA(Potato dextrose agar)培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂 15～20 g，加水至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min；富集培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g，加水至1 000 mL，121 ℃灭菌 20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 产香菌分离方法 分别采用组织块分离法、组织匀浆法和富集分离法从荔枝果肉中分离产香菌[14-15]，用PDA培养基对分离得到的菌株不断纯化，得到单一菌株。组织块分离法、组织匀浆法和富集分离法分离得到的菌株，分别用“ZKF+序号”、“ZYF+序号”和“ZFF+序号”表示。

1.2.2 产香菌株初筛方法 将分离纯化的菌株分别接入PDA培养基，在28 ℃条件下培养2～3 d。由4位专业审评员感官评选出产香浓郁且风味怡人的产香菌，初筛出较优的产香菌株。

1.2.3 产香菌株复筛方法 将绿茶以1∶50的茶水(沸水)比浸提10 min，过滤，茶汤以细菌瓶分装为10 mL/瓶，以121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。将初筛产香菌株接入茶汤中，设置对照(不接菌)，置于28 ℃摇床中培养5 d，得菌种液。取灭菌茶叶(20 g/瓶)，接种10 mL菌种液。试验设置CK(绿茶不添加外源物的空白对照茶样)、C1(绿茶添加10 mL无菌水的茶样)、C2(绿茶添加10 mL 2%无菌茶汤的茶样)3个对照。所有样品于28 ℃培养箱培养10 d。参照黑茶审评标准，评价时侧重于茶叶香气，由5位审评员进行审评，确定评分指标及其权重。茶用荔枝产香菌发酵茶综合得分=香气得分×40%+汤色得分×20%+滋味得分×30%+叶底得分×10%。依据综合得分，复筛出最佳产香菌株。

1.2.4 产香菌株鉴定 对复筛出的产香菌株进行形态学观察和分子生物学鉴定。分别在光学显微镜下和电子显微镜下观察菌株的显微结构，根据菌株形态结构判断菌株种属。用试剂盒提取菌株DNA，选用引物(NL-1:5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和NL-4:5′-GGTCCGTGTTTCAAGA-CGG-3′)进行PCR扩增。PCR扩增程序： 94 ℃变性1 min，52 ℃延伸1 min，72 ℃复性1 min 30 s，30个循环。PCR反应体系100 μL：Taq酶(5 U/μL)0.8 μL、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)10 μL、dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)8 μL、模板DNA 2.5 ng、引物NL-1(10 μmol/L)2 μL、引物NL-4(10 μmol/L)2 μL，用ddH2O补至100 μL。用1%琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物，对所得产物进行测序，以BLAST软件对所得序列进行同源性比对，将比对结果中同源性较高的序列挑选出，采用MEGA 4.1软件对其进行分析，构建系统发育树，确定产香菌株种属[16]。

2 结果与分析

2.1 茶用荔枝产香菌初筛

以组织块分离法、组织匀浆法和富集分离法分别从荔枝果肉中分离产香菌，均分离培养得到单一菌株。将从荔枝果肉中分离纯化得到的单一菌株分别接种于PDA培养基平板上培养，经感官评价对产香菌进行筛选，初筛出6株具有较高产香能力的菌株(表1)。由表1可知，荔枝ZFF1具有果香，但其香气较淡，有酸味，且不清新；其余5株菌株均具有发酵香或米酒香，其中，荔枝ZYF3香气最为浓郁。初筛的产香菌产米酒香的较多，推测这几株产香菌可能为酵母菌，但各菌株的香气浓郁程度和类型仍然存在一定差别。通过3种常规的真菌分离方法均分别从荔枝果肉中仅分离出2株产香能力较高的菌株，这说明荔枝果肉中产香菌株偏少。

表1 茶用荔枝产香菌株产香能力初筛结果

注：+代表香气浓度，+越多表示香气浓度越大。

Note:+ represents the concentration of aroma,and the more + means the more aroma concentration.

2.2 茶用荔枝产香菌复筛

由表2可知，整体上各接菌发酵茶综合得分都高于对照茶样，说明产香菌对发酵茶品质的形成有促进作用。就香气而言，CK茶样香气表现为酸、陈香；C1茶样香气表现为纯正；接种荔枝ZYF3的发酵茶样香气表现为怡人甜香、略带烟味；接种荔枝ZFF2的发酵茶样香气表现为豆豉香；其余4株产香菌发酵茶香气不突出，说明荔枝ZYF3和ZFF2能够明显改善茶叶香型，提高茶叶品质。此外，接种荔枝ZYF3发酵茶样汤色表现为红色、明亮，滋味醇和似米汤，综合得分为75.23；接种荔枝ZFF2发酵茶样汤色表现为红色、略浑，滋味呈豆豉味，综合得分为75.03。综上，判定荔枝ZYF3为最佳产香菌。

表2 茶用荔枝产香菌发酵茶的感官品质Tab.2 Sensory quality of fermented tea by aroma-producing strains for tea from litchi

2.3 茶用荔枝产香菌株鉴定

2.3.1 茶用荔枝产香菌株形态特征 利用形态学观察和分子生物学方法对荔枝ZYF3菌株进行鉴定。从图1可以看出，荔枝ZYF3菌落为白色蜡质状，菌体为藕节形，个体形态为椭圆形，细胞表面光滑，无鞭毛，质地较均匀，大小为2～5 μm。综上，推测荔枝ZYF3为酵母菌。

图1 茶用菌株荔枝ZYF3的菌落(A)、电子显微镜(B)和光学显微镜(C)观察结果Fig.1 Observation by colony (A),electron micrograph (B) and micrograph (C) of aroma-producing strain ZYF3 suitable for tea from litchi

2.3.2 茶用荔枝产香菌株分子生物学鉴定 26S rDNA(D1/D2区域)位于酵母核糖体大亚基的5′端，大小在600 bp左右，这段区域具有较高的变异率。同种菌株26S rDNA(D1/D2区域)核苷酸差异率较小，不同种菌株差异率较大，因此，常利用26S rDNA(D1/D2区域)序列进行亲缘关系较近的菌株分类研究。利用PCR技术获得ZYF3菌株的26S rDNA(D1/D2区域)序列，根据不同微生物序列的相似性获得系统发育进化树[17]。由图2可以看出，ZYF3菌株的26S rDNA(D1/D2区域)序列与泰国有孢汉逊酵母(Hanseniasporathailandica)的相似性最高，为100%。结合菌体形态特征，判定荔枝ZYF3为泰国有孢汉逊酵母。

图2 基于26S rDNA(D1/D2区域)序列的茶用产香菌ZYF3系统发育进化树Fig.2 The phylogenetic tree of aroma-producing strain ZYF3 suitable for tea from litchi based on 26S rDNA(D1/D2 region) sequences

3 结论与讨论

新鲜荔枝是常见的鲜食水果，香味独特。目前，国内外对荔枝内生真菌的研究主要集中于内生真菌生物防治[18]和荔枝采后保鲜处理[19]方面，但依然有关于荔枝内生真菌产香的研究[20-21]。周丽娟等[20]从新鲜荔枝中分离出4株产香菌，优选出的Lizhi-01菌株主要香气成分为β-苯乙醇，其次为糠醛及十六酸，其发酵制得的香精可使香烟具有明显的柔和烟气，并提高烟气细腻性和甜润感。边金勇等[21]从荔枝果皮和荔枝干等样品中分离到多株野生酵母菌株，优选出的酵母菌株10-05在发酵能力和口感风味方面均强于市售活性干酵母，可用于发酵风味独特的荔枝果酒。由此可见，荔枝中可以筛选出产香菌。本研究结果表明，荔枝是筛选产香菌的适宜材料。

本研究从荔枝果肉中筛选出的最优产香菌，经鉴定为泰国有孢汉逊酵母。泰国有孢汉逊酵母广泛存在于很多水果中，并被用来增香发酵。如李豪等[22]从自然发酵的草莓果酒中分离鉴定出泰国有孢汉逊酵母和葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)。杨莹等[23]发现广西野生葡萄发酵2 d前仅有泰国有孢汉逊酵母存在，其是启动葡萄发酵的菌株。赵海霞等[24]从苹果园土壤中筛选出产香菌，并可发酵制得风味优异的苹果酒，将最佳产香菌鉴定为泰国有孢汉逊酵母。泰国有孢汉逊酵母属于有孢汉逊酵母属，该属的酵母发酵能力强、产酯产香良好、可以增加发酵品的风味[23]。由此可见，泰国有孢汉逊酵母属于安全菌株，可应用于发酵产香。

本研究中泰国有孢汉逊酵母是经过固态茶叶发酵后复筛出来的，表明其能耐受茶叶的抑菌活性，且生长良好，表明可应用于茶叶发酵产香。除产香外，酵母菌可在茶叶发酵过程中转化代谢。众所周知，酵母菌富含氨基酸、B族维生素等活性成分，产香发酵后，无疑可给发酵茶增香，并增添很多活性成分，有利于开发特色发酵茶产品。当前，我国夏秋茶资源浪费严重，借助泰国有孢汉逊酵母对夏秋茶进行发酵生产，有望促进夏秋茶资源的高效开发利用。