凤丹花粉活力与柱头可授性及其繁殖特征研究

罗长维,陈 友,刘 云

(1.重庆城市管理职业学院，重庆 401331； 2.西南大学 生命科学学院，重庆 400715)

繁殖成功是植物适应环境变化的集中体现[1-3]。植物繁殖主要包括有性繁殖与无性繁殖，前者是新基因形成和新基因型产生的主要方式，也是大多数开花植物增加个体数量的主要方式。确定有性繁殖是否成功的一个主要标准是结实率与单果种子数量的大小，在自然授粉情况下，凤丹(Paeoniaostii)的结果率与单果结籽数量分别可达86.0%与49.0粒，与人工异交授粉无显著差异[4]。从传粉媒介角度分析，可能是凤丹具有泛化传粉关系的访花昆虫进行高效授粉的结果。从有性生殖角度看，开花植物的生物学特性适应于其传粉机制：有效的传粉是以高效的授粉媒介、大量的花粉和合适的接受柱头为基础[5]。花粉须在具有活力时到达处于可授期的柱头方能完成授粉过程。花粉存活期的长短与柱头适宜授粉时间的长短结合在一起，极大地影响着植物的自交授粉率、授粉成功率等[1,6-7]，特别是异交传粉的植物。生殖同步性被普遍认为是促进植物繁殖成功的主要因子[8-9]。因此，花粉活力保持时间、柱头可授期以及花期相遇(包括开花同步性)等成为促进凤丹繁殖成功所必须关注的问题。

凤丹为杨山牡丹栽培种，属芍药科(Paeoniaceae)芍药属多年生落叶小灌木，广泛种植于我国亚热带与温带地区[10-11]。凤丹繁育系统主要为异交繁殖，自交结果率与单果结籽数量及种子质量均非常低[4]。作为一种优质食用油原料植物，凤丹种子油富含不饱和脂肪酸，其中具“血液营养素”之称的α-亚麻酸(α-linolenic acid，ALA)含量高达42%，远高于其他食用油[12]。目前，关于凤丹的研究大多集中于栽培管理、自毒物质检测、遗传多样性以及灰霉病流行特征等方面[10-13]，而对其繁殖特性的研究非常少见。鉴于此，在对凤丹花粉活力与寿命及其柱头可授期进行室内化学检测以及田间套袋观测的基础上，结合其群体花朵开放式样的调查结果，分析其有性生殖成功的成因，为凤丹有性繁殖机制的揭示及其高效栽培管理、常规杂交育种等提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验于2017—2018年进行。试验地点位于重庆市垫江县长龙镇(107.406 42°E、30.305 57°N，海拔385 m)。垫江县位于重庆市东北部，地貌以低丘为主，年均温17 ℃，年均降水量1 160 mm，年均日照时数1 260 h，为中亚热带季风性湿润气候。凤丹群体花期为3月上旬至下旬，盛花期为3月中旬，果期为同年7—8月。凤丹栽培为当地村民主要经济来源之一，常年种植面积达1 000 hm2。

1.2 凤丹花部特征调查

选择标记10株凤丹标准植株及花朵，观察花朵颜色、形状、气味、有无花蜜等。选取即将开放的单花，每天观测其单花开放进程，包括花瓣展开、雄蕊位置变化、花药开裂、花粉释放、柱头表面有无分泌液等。随机选取30朵花，观测花部形态，并测量花冠直径、雄蕊数目、心皮数目以及胚珠数目等花部特征。

1.3 凤丹花粉活力检测

选择生长一致、即将开放的凤丹花朵，套袋标记10朵(1朵/株)，分别于开花后第1、2、3、4天收集供试花粉。花粉活力检测采用TTC染色法进行：将供试花粉置于载玻片中央，并以高温加热致死的花粉作参照[14]，将1～2滴0.5% TTC溶液滴于供试花粉中，混合均匀后覆上盖玻片，置于内有湿润滤纸的培养皿里，于37 ℃条件下放置20 min,在Olympus显微镜下进行观察记录。花粉为红色表示有活力，若为黑色或无颜色变化或浅红色则表示无活力。每一制片观察5个视野，统计花粉总数与有活力的花粉数目，计算有活力花粉所占比例。重复10次。

1.4 凤丹柱头可授性检测

用联苯胺-H2O2气泡染色法即过氧化物酶染色法检测凤丹柱头可授性[14]，柱头表面的过氧化酶活性与柱头可授性呈正相关。分别采集花后不同天数的柱头备用。将柱头置于凹形载玻片上，将联苯胺-H2O2溶液(V1%联苯胺∶V3% H2O2∶V水=4∶11∶22)置于供试柱头。在Olympus解剖镜下观察，柱头染色越深、周围气泡越多表明柱头可授性越强，反之则越弱，无气泡产生且不变蓝表明柱头无可授性。

1.5 凤丹花粉活力和柱头可授性的套袋检测

采用去雄、硫酸纸套袋及人工异花授粉方法测定花粉活力与柱头可授期。花粉活力的套袋检测：标记1朵即将开放的花朵，于开花后第1、2、3、4天采集花粉，同时每天分别标记30朵即将开放的异株花朵，取花后不同天数的花粉为柱头授粉。柱头可授性的套袋检测：每个处理随机标记30朵花朵，在单花开花后第1、3、5、7天分别取异株花朵花后第1天的花粉对柱头进行人工授粉。以上处理均在授粉后60～70 d记录结果与结籽情况。所有处理均重复3次。由于大部分花朵均能结果并产生不同数目的种子(个别花朵因感染灰霉病停止发育)，因此检测结果以单果平均种子数量进行统计。

试验所用套袋花朵均在花朵尚未开放、柱头表面无花粉、花药未开裂时进行去雄处理。人工异花授粉时间参照同一群落中其他未套袋花朵的自然授粉时间。同样，参照同一群落其他未套袋花朵，在柱头干枯、心皮明显增大、花瓣已经枯萎凋落时去掉套袋。在套袋期间，经常对供试花朵进行观察，同时揭袋通风换气，避免花器霉变。

1.6 凤丹花开放式样调查

开放式样指花朵开放数量在群体水平上表现出的时空动态。在试验点分别选取位于南坡(样地1)、东坡(样地2)、西坡(样地3)的3块样地，在每块样地内选择长势较好、花朵尚未开放的植株约300株进行标记。观察记录植株上的花朵数量和群体开放动态，即从第1朵花开放开始，每天记录1次开花情况，直至所有花朵全部开放。最后统计每天开放的花朵数量占花朵总数百分比，以开放花朵数占花蕾总数的5%为始花期，凋谢花朵数大于花蕾总数的95%为末花期。

群体的开花同步性检测采用开花同步性指数Xi进行[9]，计算公式如下：

式中，n为开花群体中调查个体的总数，fi为个体i开花的总天数，ej表示个体i和j花期重叠天数(j≠i)。Xi值的变化区间为0～1，当Xi=0时表明个体花期完全没有重叠，当0

1.7 数据分析

花部形态特征、花粉活力等的观测结果以平均值±标准误(Mean±SE)表示。采用 SPSS 22.0软件对凤丹开花后不同天数的花粉活力差异，以及花粉活力与柱头可授性变化的套袋检测结果进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 凤丹花部形态特征

凤丹花冠硕大，直径达(15.3±0.2)cm，开放时呈浅盘状。单花顶生，两性，无花蜜，有轻微气味。花冠白色(偶淡粉色)，花药黄色，花丝淡紫色，柱头紫红色。雄蕊多数，雄蕊群直径(3.5±0.1)cm。花药二室，长圆形，开裂时能释放出大量肉眼可见的亮黄色花粉。花粉粒外壁光滑，不具黏性，轻摇花朵可见大量花粉掉落花盘基部。柱头常5枚(偶6～8枚)，呈“C”形，并于上端与花柱合生。柱头表面密被刷状柱头毛，能分泌黏液。子房上位，心皮5(偶6～8)，单心皮具(13.3±0.3)枚胚珠，子房具(67.0±2.8)枚胚珠。

2.2 凤丹花粉活力

凤丹单花期4～7 d。第1天，当蓇葖露出约2～3 cm时，花瓣逐渐裂开至展平，花药由黄白变黄，花丝由紧贴子房变为逐渐伸长并分散、远离柱头(图1A)。花药两侧药室同时由顶端向下纵裂散粉，开裂长度为药室长度的2/3(图1A)。第2天，药室继续往下开裂，至中午即完全开裂(图1B)。第3天，药室上部失水干瘪，颜色由黄色变为黄褐(图1C)。第4天，整枚花药变得干瘪，颜色从黄红变黄褐。药室壁花粉残留在药室壁或散落在花盘基部。花丝逐渐失水干枯，上部颜色由紫色变紫白。傍晚开始部分脱落(图1D)。花瓣仍可保持数天新鲜。在连续阴天里，花药不能开裂释放花粉，或者出现花药发育不良(如雄蕊瓣化或仅有花丝没有花药)。

凤丹花粉寿命为4 d。第1天上午9：30左右，花药开始开裂散粉。花粉活力在4 d之间差异显著(F=33.39,df=3,P<0.05，表1)。第1天花粉活力最高，为(65.2±2.6)%；第2天花粉活力为(57.4±2.5)%，与开花第1天花粉活力无显著差异(P=0.42)。第3天，花粉活力降低到(43.9±1.8)%，与开花第2天花粉活力存在显著差异(P<0.05)。第4天，花粉活力降为(19.5±2.2)%，与开花第3天花粉活力存在显著差异(P<0.05)。

A.第1天开始释放花粉; B.第2天花粉完全释放; C.第3天药室上部变枯; D.第4天雄蕊干枯部分脱落； 标尺=2 cm A.Stamen began to release pollen at the 1st day; B.Stamen released all pollen grains at the 2nd day; C.Upper part of anther locules began to dry at the 3rd day; D.Stamen began to dry and fall off at the 4th day; Scale bars=2 cm图1 凤丹单花开放过程 Fig.1 Flowering dynamic of Paeonia ostii

表1 凤丹开花过程中花粉活力与柱头可授性的日变化Tab.1 Daily changes in pollen viability and stigma receptivity of Paeonia ostii during flowering process

注:*表示雄蕊部分脱落,++++表示柱头可授性最强; +++/-表示柱头可授性较强; ++/--表示柱头可授性中等; +/---表示柱头可授性较弱; ----表示柱头失去可授性；同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:*means some anthers falling off,++++means stigmatic receptivity(SR) is the highest; +++/- means SR is high; ++/--means SR is moderate;+/--- means SR is low; ----means SR is lost;Different letters in the same column mean the significant difference(P<0.05).

2.3 凤丹柱头可授性

由表1可见，凤丹柱头寿命4～7 d。第1天，柱头逐渐展开，柱头表面最初较硬，且无昆虫访花。下午逐渐变软，有昆虫访花，傍晚即可黏附较多花粉。第2天，未授粉柱头表面开始分泌黏液。第3天，未授粉柱头可见黏液流到柱头底端。第4天，未授粉柱头表面开始部分变干变硬，柱头底端黏液凝结成透明胶体。柱头颜色在开花后第1～4天为紫色，第5～8天由亮紫色变为暗紫色。开花后第8天，仍未授粉的柱头表面完全变干变硬。柱头宿存心皮至果熟。

由表1可见，凤丹柱头可授期为4～7 d。第1天柱头表面具有较强过氧化物酶活性，可授性较强；第2～3天柱头具有强过氧化物酶活性，可授性最强。第4天后，柱头过氧化物酶活性降低，可授性逐渐降低。随着开花天数增加，柱头可授性继续降低。到第8天，几乎所有柱头表面变干，表明柱头表面不再有过氧化物酶活性而失去可授性。在连续阴天里，柱头表面比较硬，可授性非常低。可见，凤丹花粉活力与柱头可授期重叠，且由于柱头可授期相对较长，有利于提高授粉概率。

2.4 凤丹花粉活力和柱头可授性的套袋检测结果

利用去雄、人工异交授粉与套袋检测方法发现，开花后第1、2、3、4天的花粉均具有活力，开花后第1、3、5、7天的柱头均具有可授性(图2)。可见， 套袋结果与TTC方法测定的花粉活力以及用联苯胺-H2O2法检测的柱头可授性结果总体一致，即花粉活力或柱头可授性较低的时候，其结籽量也较低，反之亦然。采用花后第1、2、3、4天的花粉对凤丹柱头进行授粉后， 结籽量差异显著(F=8.50，df=3，P<0.05，图2)。其中，花后第1天与第2天的花粉授粉后的单果结籽量最高，二者之间差异不显著(P>0.05)；花后第3天的花粉授粉后仍具有较高的结籽量，与花后第2天的花粉授粉后的结籽量差异不显著(P>0.05)；花后第4天的花粉授粉后结籽量显著低于第3天(P<0.05)。总体看来，由于套袋检测均为人工异花授粉，柱头能够接受到充足异交花粉，因此，在花粉活力不高时仍有相对较高的结籽量。

A.不同日龄花粉授粉后的单果结籽数； B.不同日龄柱头授粉后的单果结籽数；不同小写字母表示差异显著(P<0.05) A.Seeds per follicle after different days of pollen grains pollinated to the 1st day stigma; B.Seeds per follicle after different days of stigma being pollinated with the 1st day pollen grains; Different letters mean the significant difference(P<0.05) 图2 凤丹花粉活力与柱头可授性的结实检测 Fig.2 Seeding test of pollen viability and stigma receptivity of P.ostii

柱头可授性对植物的繁殖成功也起着重要作用。凤丹花后第1、3、5、7天的柱头在接受异花花粉后，其结籽数差异显著(F=23.39，df=3，P<0.05，图2)。其中，以花后第1、3天柱头具有较高可授性。花后第3天柱头授粉的结籽数与第1天较为相近(P=0.48)，表明第3天的柱头可授性较高，因此单果结籽数主要受花粉活力影响。柱头花后第5天授粉后的结籽数与第3天结籽数差异显著(P<0.05)，第5～7天，柱头可授性下降很快，凤丹果实产生少量种子，甚至无法结籽，单果结籽数差异显著(P<0.05)。

2.5 凤丹花朵开放式样

凤丹群体花期为3月中旬至4月初，凤丹植株所在样地不同，群体花朵的开放持续时间也有差异(图3)。群体开花平均持续时间为17.7 d(15～19 d)，其中始花期持续6.7 d(6～8 d)，开花比例不到5%，随着开花比例增加逐渐进入盛花期，持续时间为7.7 d(7～8 d)，最后进入末花期，持续时间3.3 d(1～5 d)。从开花动态看，开花比例在前期较低，随着时间推移缓慢上升至高峰期，随后快速下降，开花曲线整体呈单峰模式。开花同步性观测结果表明，样地不同，花期重叠期也有所差异，花期同步指数分别为0.78、0.83、0.85，平均为0.82。因此，凤丹群体开花同步性显著，呈“集中开花模式”。

图3 凤丹花不同样地群体开花特性Fig.3 Flowering features of Paeonia ostii population in different sample plots

3 结论与讨论

植物花粉存活时间的长短，一方面由遗传因素所决定，另一方面也受环境因子的影响[9,15]。如刺五加(Acanthopanaxsenticosus)长花丝植株的花粉活力高于中花丝植株，花粉活力及其降低快慢随环境变化而有所不同[16]；海枣(Phoenixdactylifera)的花粉可存活数月至1 a；茄(Solanummelongena)的花粉在冬季可以存活3 d，在夏季仅能保持1 d[17]。对凤丹花朵而言，其花粉可存活4 d，花粉活力第1、2天最高，第3天显著降低，至第4天花药药室与花丝逐渐枯萎，仅有少量花粉存活。根据这一特征，可以采集凤丹开花后第1、2天的花粉贮存备用或进行人工授粉，为其异地引种或杂交育种提供技术保证。凤丹花粉不具黏附性，由于昆虫访花频繁而大量掉落于花盘，且凤丹花期临近清明，由于雨水的冲刷，花粉较易折损。凤丹的花粉胚珠比(P/O比)高达58 940，极高的P/O比可以补偿由于降雨冲刷及蜂类收集花粉而引起的花粉损失。

柱头可授性为植物两性繁殖中最关键的环节之一，其可授期保持时间的长短直接影响花朵的授粉结实[3,14]。不同植物的柱头可授期也有所差异，持续时间从数小时到几十天不等，并受开花后天数、单花期长短、同一天不同时段以及柱头表面有无分泌物等因素的影响。如大花蕙兰(Cymbidiumhybridum)的柱头在整个花期中均具有一定的可授性，以开花后20～40 d 的可授性最强，45 d 以后柱头可授性逐渐减弱[18]；多枝柽柳(Tamarixramosissima)柱头在花朵未完全开放时就已有可授性，完全开放至花后4 h可授性达到最强[19]。此外，柱头可授性与花部形态特征之间也有对应关系[2]。凤丹为两性花，无蜜腺，提供给访花昆虫的唯一酬物为大量花粉。因此，一旦花朵的雄蕊开始枯萎，访花昆虫数目很快减少。由于凤丹花朵呈现集中开放，花期后期开放花朵较少，有少量访花昆虫，蜂类与甲虫也会访问花丝枯萎、药室由黄色变为黄褐色的花朵，同时也增加了柱头的授粉概率。

近年来,植物花朵开放式样与授粉媒介及花粉流之间的相互影响引起一些科研人员的关注[3,20]。HARDER等[21]通过人为控制水浮莲(Eichhorniacrassipes)两性花的开放数目，发现多花的开放式样显著增加了传粉媒介的访问。凤丹为两性花植物，繁育系统为异交繁育系统，自交结籽率极低，只有通过昆虫才能完成异花传粉过程。凤丹花的雄蕊寿命仅4 d，花粉活力较低，从开花到凋谢，昆虫仅有4 d的访花时间。倘若有不良环境因子出现(如雨水、阴天等)，昆虫无法及时访花，无疑会影响凤丹的传粉与结实，这显然不利于凤丹的繁殖成功。然而，凤丹开花特性及繁殖对策具有较强的适应性。首先，凤丹花冠硕大，雄蕊数量多且呈亮黄色，对昆虫的招引作用明显。其次，凤丹具有较大开放式样。凤丹单花顶生，群体花朵的开花同步性高，呈集中开花模式，亦为适应多变环境条件提供了一定的繁殖保障[9,22-23]。凤丹花瓣在雄蕊枯萎后仍可保持数日新鲜，使花展示更为醒目。因此，凤丹花的开放式样与视觉吸引共同作用增加了对访花者的吸引力，提高了对花朵的访花频率，进一步促进植物的花粉散布与繁殖成功。

总体而言，花粉活力与柱头可授性是植物有性繁殖过程的重要组成部分，并进一步影响授粉成功率。凤丹花粉活力保持4 d，柱头可授性可保持4～7 d，群体具有集中开花模式，相对较长的花粉寿命与柱头可授期以及较大的开放式样为其大量产生种子提供了前提条件。此外，凤丹在雌雄功能上表现为花粉先成熟，花粉存活时间与柱头可授期表达时间大部分重叠，为其自花授粉提高了概率。尽管凤丹繁育系统为自交亲和力低的异交繁育系统，但大量自花花粉滞留柱头必然会导致柱头堵塞，影响异源花粉的扩散与萌发。因此，凤丹是否存在其他机制避免自花花粉在柱头上散布，还需进一步研究。