基于分子印迹检测盒的智能手机血糖测定方法研究

信建豪，张翠利，张利娟，王欢欢，李 锟

(黄河科技学院 医学院，河南 郑州 450063)

葡萄糖是生物体中新陈代谢不可缺少的能量物质，其在生物体内发生氧化还原反应时所释放出的能量是生物体生命活动的直接能量来源。如果人的胰岛素分泌缺陷或生物作用受损，将引起糖尿病这种“不治之症”，长期的高血糖将导致各种组织，特别是眼、肾、血管、神经的慢性损伤及功能障碍，给人类健康和生活带来了极大影响[1]。目前，血液中葡萄糖的检测方法主要有碘量法[2]、化学发光法[3]、高效液相色谱法[4]、酶法[5-6]等。其中酶法已成为居家诊断的常用方法，但其检测血糖所用的酶价格较高，且还需血糖仪配合诊断。若能利用价格低廉的化学试剂代替酶，再应用智能手机代替血糖仪，检测成本将更加低廉，使用更方便。

分子印迹技术是指以待测目标分子为模板分子，合成具有专一识别功能的分子印迹聚合物的一种技术，具有制备简单、特异性好、可重复使用、稳定性高、抗恶劣环境能力强等显著优点，被广泛应用于分离、分析、生物医学研究等领域[7]。分子印迹的识别特异性，可用于模拟酶、抗体或抗原的专一性[8]识别，具有成本低廉，操作简单，使用方便等优点。

目前智能手机迅速发展，几乎达到了“人手一部”的地步，智能手机易于携带、计算性能强、数据传输方便、软硬件易于扩展等优势，使之便于在疾病诊断方面进行开发研究。相比于现阶段常用的血糖仪，使用手机可减小设备的投入，降低成本；还可进行数据共享，由专业检验师在线数据分析，实现居家诊断，已成为一个十分令人关注的研究热点[9-10]。如Pavla等[11]以气泡膜为载体，将葡萄糖氧化酶和过氧化物酶固定至其表面，加入葡萄糖进行氧化和盐酸苯二胺显色，最后用智能手机拍照，根据色度大小检测葡萄糖含量。但该方法仍需使用酶。迄今，采用分子印迹技术制备检测试纸，通过对目标化合物进行富集后，加入显色剂进行显色，最后采用智能手机拍照和软件GIMP 2.8色度识别，用以检测目标化合物含量的方法未见报道。本研究以葡萄糖为目标分子，建立了分子印迹试纸富集后显色，智能手机检测血液中葡萄糖检测的新方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

FA1004型电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；KQ-300V型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；场发射扫描电镜FEI Quanta 250FEG(美国FEI公司)；TU1810型紫外可见分光光度计(上海普析)；真空采血管、血细胞过滤器、4孔检测板、醋酸纤维膜套装购于上海金标生物科技有限公司。

葡萄糖标准品购于酷尔化学试剂公司；α-甲基丙烯酸、N,N-二亚甲基双丙烯酰胺购于上海阿拉丁试剂有限公司；显色剂由0.05 mL甲基橙指示剂、0.05 mL甲基红指示剂、0.2 mL甲基红-溴甲酚绿指示剂和2 mL 0.6 mg/mL硼酸混匀后超声数秒制得。其余试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 实验过程

1.2.1 葡萄糖分子印迹检测盒的制备精确移取25 μL功能单体α-甲基丙烯酸分别加入到5 mL 1.0 mg/mL的葡萄糖水溶液中，超声混合10 min，加入0.041 0 g交联剂(N,N-二亚甲基双丙烯酰胺)，再超声40 min后于5 ℃冰箱中静置12 h。取出恢复至室温后加入20 mg引发剂(过硫酸铵)，再超声8 min即得粘稠状的葡萄糖分子印迹聚合物。

图1 葡萄糖分子印迹检测盒Fig.1 Glucose molecule imprinted determination kit

将醋酸纤维素膜浸入制备的葡萄糖分子印迹聚合物中30 min后，置真空干燥箱中于45 ℃下干燥25 min。然后用打孔器将葡萄糖分子印迹聚合物的醋酸纤维素膜打出圆形小片，即得葡萄糖分子印迹试纸。将制备好的试纸置于4孔检测板的空穴中，用纯化水对反应区进行多次洗脱，直至采用硫酸-苯酚法检测不出洗脱液中的葡萄糖，最后置于真空干燥箱内于45 ℃干燥30 min，即得葡萄糖分子印迹检测盒(图1)。

1.2.2 葡萄糖测定方法在洗脱后的检测盒反应区内滴加20 μL试样溶液，静置5 min后用100 μL氯仿洗涤反应区(20 μL/次)，以清洗去除游离物质。再滴加20 μL显色剂于反应区，静置10 min使其反应显色。将检测盒与智能手机放置于自制的手机拍照装置中，对检测盒中反应区进行拍照，然后用免费软件GIMP 2.8中的拾色器检测孔中的红色色度数据，以色度为测定值，代入工作曲线，计算试样中的葡萄糖含量。

图2 葡萄糖分子印迹试纸洗脱前(A)与洗脱后(B)的电镜扫描图Fig.2 SEM figures of glucose molecule imprint test paper befor(A) and after(B) elution

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖分子印迹材料设计

制备分子印迹材料的方法有本位聚合[12]、悬浮聚合[13]、表面印迹[14]、冰胶印迹[15]等，考虑到所制备的分子印迹试纸须有一定的韧性，避免在打孔、安装时引起聚合材料破损从而影响结果的精密度,本文采用冰胶聚合法，以N,N-二亚甲基双丙烯酰胺为交联剂。实验考察了4-乙烯吡啶、α-甲基丙烯酸和丙烯酰胺常用的功能单体对测定的影响，结果发现，以4-乙烯吡啶为功能单体时，生成的聚合物有颜色，干扰测定，以丙烯酰胺为功能单体时的吸附性能较差，而以α-甲基丙烯酸为功能单体时测定效果最佳。

2.2 葡萄糖分子印迹材料的形貌

采用场扫描电镜对葡萄糖分子印迹试纸表面洗脱前后进行扫描(图2)。图中的纹理由印迹材料聚合在试纸表面形成，比较发现洗脱后的葡萄糖试纸表面更为粗糙，说明洗脱对试纸表面产生了影响，使分子空穴产生。

2.3 吸附时间及吸附温度的选择

在5 mL 0.4 mg/mL葡萄糖溶液中加入一片葡萄糖印迹试纸，采用紫外分光光度计检测溶液吸光度随时间的变化。结果显示，该方法制备的印迹试纸吸附5 min即达到平衡，计算得其吸附量(Q)为0.651 mg/片，因此选择吸附时间为5 min。

在一系列5 mL 0.4 mg/mL葡萄糖溶液中分别加入一片葡萄糖印迹试纸，考察其在不同温度下吸附5 min的吸光度，计算吸附量。结果显示，当温度为30 ℃时，葡萄糖溶液的吸附量最大(Q=0.673 mg/片)。但在20～30 ℃之间，吸附量变化较小，为方便使用，选取在室温下进行测定。

图3 葡萄糖试纸对葡萄糖(a)、肌酐(b)、谷氨酸(c)、牛血清白蛋白(d)和尿素(e)的吸附动力曲线Fig.3 The adsorption kinetics ofglucose(a),creatinine(b),glutamate(c),BSA(d) and urea(e) with glucose imprinted paper

图4 手机拍照装置示意图Fig.4 Diagram of take pictures for mobile

2.4 特异识别性的研究

考察了血液中共存的物质对血液中葡萄糖提取的影响，分别在5 mL 0.4 mg/mL的葡萄糖、尿素、肌酐、谷氨酸和白蛋白溶液中加入一片葡萄糖印迹试纸，测定其吸附量随时间的变化曲线(图3)，结果显示，葡萄糖印迹试纸对尿素、谷氨酸和白蛋白的吸附量较小，对肌酐的吸附量较大，但采用5 min作为吸附时间时，对肌酐的选择性系数也达到25倍，因此对葡萄糖的测定影响较小，表明葡萄糖试纸的特异性良好。

2.5 显色剂的选择

可使葡萄糖显色的试剂有杂多酸[16]、3，5-二硝基水杨酸[17]、蒽酮[18]和铁-邻菲罗啉[19]等，但若要实现快速测定，需显色反应能够快速、灵敏地发生。因此采用硼酸与葡萄糖的多羟基发生配位，生成酸性物质，该反应能够快速、定量完成。生成的酸性物质用指示剂进行作用，使颜色发生变化。结果表明，以0.05 mL甲基橙、0.05 mL甲基红、0.2 mL甲基红-溴甲酚绿指示剂和2 mL 0.6 mg/mL的硼酸混匀经超声后制得的显色剂与葡萄糖作用后产生的颜色仅有红色，无杂色的干扰，且显色速度快，因此采用上述组成配制显色剂。

2.6 拍照影响因素考察

在拍照识别色度中，为避免光线和拍摄角度对测定结果的影响，本研究自制了手机拍照装置(图4)：将检测盒置于暗盒中，用一个Led白色灯带提供光源；手机放置在暗盒上面，摄相头通过固定的孔进行拍照来保持光线和角度的稳定。为使条件更加一致，将2个4孔检测盒同时置于暗盒中，使试样溶液与标准溶液同时显色，消除操作误差。

2.7 工作曲线

配制5 mL 10.0～1.00×10-7mg/mL质量浓度范围内的一系列不同浓度的葡萄糖标准溶液，在优化条件下测定，以GIMP 2.8软件中拾色器采集的色度(H)为纵坐标，葡萄糖浓度的负对数(pC)为横坐标绘制工作曲线，结果显示，葡萄糖浓度的负对数与色度呈良好的线性关系，线性方程为H=421-23.3pC，相关系数(r)为0.993，检出限为5.7×10-7mg/mL。

2.8 精密度及稳定性实验

取1.00×10-5mg/mL葡萄糖标准溶液，在优化条件下测定其色度值，连续测定5次，其相对标准偏差(RSD)为2.3%(临床分析要求RSD<10%)，并在6个月内每日测定一次，计算得日间RSD为5.4%。表明本方法精密度良好，且在6个月内稳定。

2.9 实际样品测定与加标回收实验

取3只符合实验规格的家兔，将其固定，用静脉血样采集针刺破耳缘静脉使血液流进负压管适量，取血后以棉球压迫止血。然后将所得兔血用血细胞过滤器过滤后，取续滤液20 μL在优化条件下测定，代入线性方程后计算血液中葡萄糖含量，并与罗氏家用血糖仪进行对照(表1)。

分别取0.200、0.500、1.00 mg/mL葡萄糖溶液和等体积的实际血液样品混匀，经血细胞过滤器过滤后取20 μL加入葡萄糖分子印迹试纸，在优化条件下考察其回收率(表1)。结果显示，葡萄糖在3个加标浓度下的回收率为91.8%～108%，RSD为8.2%～8.6%，表明本方法准确度良好，与家用血糖仪结果无显著性差异，可用于实际检测。

表1 测定结果与回收率试验Table 1 Results of determination and recovry

3 结 论

本文以自制的葡萄糖印迹检测盒作为血液中葡萄糖的分离、显色装置，配合智能手机的摄相头进行拍照，再采用免费软件GIMP 2.8检测色度，实现了血液中葡萄糖的测定，该方法检测速度快、吸附量大、选择性高、成本低廉、操作方便，可为居家诊断及治疗打下基础。