EMS诱变对直立型扁蓿豆出苗和幼苗生长的影响

张雨桐，石凤翎，乔雨，乔丹丹

(内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

扁蓿豆(MedicagoruthenicaL.)是苜蓿属多年生豆科牧草，主要分布于我国东北、西部、西北的多个省区，该草种抗逆性强，茎叶柔软，叶量大，是一种优质的蛋白质饲料〔1,2〕。扁蓿豆与苜蓿亲缘关系较近，可作为苜蓿品种抗性改良及苜蓿新品种培育的重要种质材料，但不足之处是其牧草产量和种子产量均较苜蓿低〔3〕。直立型扁蓿豆[Medicagoruthenica( L.) Sojak.cv.Zhilixing]是1992年培育的扁蓿豆新品种，除具有饲用价值好、抗性强等优良特性，相比野生型扁蓿豆还具有较高的草产量。在化学诱变中，EMS(甲基磺酸乙酯)是目前化学诱变效果中认可度较高的诱变剂，且在植物诱变育种方面应用相当广泛。EMS能诱发产生高密度的系列等位基因点突变，可避免由转基因带来潜在的安全性问题，因此是现代分子生物学研究中植物种质创新的有效方法〔4-6〕。而对于EMS诱变直立型扁蓿豆产生新变异体的研究却是很少。因此本试验在乔雨等人〔7〕的研究基础上，采用同一浓度(0.9%)的EMS溶液对直立型扁蓿豆2种萌发阶段的种子处理不同时间，并测定其在诱变基础上的成活率、生长指标变化及其幼苗变异率，旨在明确直立型扁蓿豆幼苗最大变异率和较高成活率的EMS最适处理，以期获得更多突变体材料，丰富直立型扁蓿豆牧草种质资源，为苜蓿属育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为直立型扁蓿豆[Medicagoruthenica( L.) Sojak.cv.Zhilixing]种子，2011年收获于内蒙古农业大学牧草试验地，经干燥处理后在4℃种子柜条件下贮藏。EMS 诱变剂(甲基磺酸乙酯)购于美国Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 EMS处理吸胀种子方法

选取粒大饱满的直立型扁蓿豆种子，用砂纸打磨以打破硬实，然后用蒸馏水预浸12h，使其达吸胀状态。用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH=7.0)配置浓度为0.0%、0.9%的EMS(甲基磺酸乙酯)溶液。分别选取100粒种子置于100ml锥形瓶中，处理组加入0.9%EMS溶液50ml，对照(ck1)加50ml磷酸缓冲液，对照(ck2)加入50ml蒸馏水，其中1000粒用EMS处理，300粒用作对照ck1，300粒用作对照ck2。封口后将其置于20℃、60r/min的摇床中处理48h。以上处理剂量组合采用乔雨等以直立型扁蓿豆种子相对发芽率达半致死剂量下得到的时间和浓度〔5〕。处理后种子用蒸馏水冲洗4h，以去除残留EMS。将各处理种子置培养皿中发芽，每皿100粒，每日按时观察，待种子发芽后将其播种于育苗盘(基质为1∶1∶1的沙土、蛭石、营养土的混合物)中，播种深度1～2cm，置于温度为25℃、湿度为60%的人工智能温室培养，培育期间水分供给一致。

1.2.2 EMS处理发芽种子方法

用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH=7.0)配制0.9%EMS溶液。分别选取100粒发芽种子(胚根长为2～5mm)，置于100ml锥形瓶中，每一处理加入0.9%EMS溶液50ml，对照(ck1)加入50ml磷酸缓冲液，对照(ck2)加入50ml蒸馏水，封口后将其置于20℃、60r/min的摇床中分别处理1h、3h、5h。每组试验3次重复，处理后的种子用流水冲洗30min，播种于育苗盘(基质为1∶1∶1的沙土、蛭石、营养土的混合物)中，播种深度1～2cm，置于温度为25℃、湿度为60%的人工智能温室培养，培育期间水分供给一致。

1.2.3 测定指标和方法

逐日记载EMS处理吸胀种子的发芽数，待连续2d无发芽则停止统计；EMS处理发芽种子播种后每隔4天观察萌发情况(以子叶顶出土层5mm为萌发标准)，并统计各处理出苗数，计算相应出苗率。20d计算相对出苗率，并随机选取10株开始测量幼苗高度，之后每隔10d测量一次，连续测量5次，计算出各处理幼苗这60d内的生长速度，取平均值。40d后计算成苗率和相对成苗率进行植株高度测定，同时统计叶片生长数目及第一片真叶及第二片真叶(中间小叶)长宽。并对幼苗的形态进行定期观察，计算变异率。计算公式如下：

发芽率(%)=(发芽总数/供试种子数)×100%；

出苗率(%)=(出苗总数/供试种子数)×100%；

成苗率(%)=(成活苗总数/供试种子数)×100%；

相对出苗率(%)=(处理的出苗率/对照出苗率)×100%；

相对成苗率(%)=(处理的成苗率/对照成苗率)×100%；

变异率(%)=(变异株数/观察株数)×100%。

2 结果与分析

2.1 EMS处理对吸胀种子萌发、出苗进程的影响

EMS处理直立型扁蓿豆吸胀种子对其种子萌发有抑制作用。由图1可知，经0.9%EMS处理48h的种子于第3d开始萌发，发芽率高峰出现在第4d，最终发芽率仅为8%；而对照ck1(磷酸缓冲液)和对照ck2(蒸馏水)处理吸胀种子分别在第3d、第2d开始萌发并达发芽率高峰，ck1最终发芽率为24.33%，ck2最终发芽率达64%。EMS处理发芽率显著低于对照(ck1与ck2)(p<0.05)，ck1与ck2也具有显著差异(p<0.05)。

图1 0.9%EMS处理直立型扁蓿豆吸胀种子48h的发芽率情况

由表1可知，EMS相对ck1发芽率为37.75%，高于相对ck2发芽率(13.87%)；EMS相对ck1的出苗、成苗率分别为96%、66.47%，均高于ck2。EMS处理的发芽率相对CK1和CK2均在50%以下，即在半致死剂量以下其出苗率和成苗率均较低。可知CK1(磷酸缓冲液)也对种子的萌发、出苗和成苗产生一定程度的影响。

表1 EMS处理直立型扁蓿豆吸胀种子的相对萌发、出苗及成苗率

2.2 EMS处理对发芽种子出苗进程的影响

当各处理出苗后，随着生长会有部分幼苗枯萎死亡。图2所示，当EMS浓度一定时(0.9%)，随着处理时间的增加，其相应的出苗率均随之降低；对照ck1(磷酸缓冲液)和对照ck2(蒸馏水)处理幼苗的出苗率存在显著差异(p<0.05)，ck1在第13d前的观测出苗率高于ck2，但在其之后ck1有明显枯萎死亡现象，可知磷酸缓冲液对种子出苗有一定影响。0.9%EMS处理1h与ck1无显著差异，其余处理与ck1有显著差异(p<0.05)；而0.9%EMS处理1、3、5h均与ck2有显著差异(p<0.05)。第4d时，ck1出苗率最高达40%，ck2出苗率为56%，EMS处理1h、3h的出苗率分别为30%，9.33%，EMS处理5h未有出苗。ck1、EMS处理1h和5h在第13d时达出苗高峰期，ck2和EMS处理3h在第16d时达出苗高峰期。播种16d后，ck1、1h、3h、5h的幼苗成活率相对稳定，播种19d时ck2的幼苗成活率趋于稳定。

图2 0.9%EMS处理直立型扁蓿豆发芽种子不同时间的出苗率情况

由表2可知，一定浓度的EMS处理直立型扁蓿豆发芽种子1h相对ck1的出苗率和成苗率有一定促进作用，其余处理时间对其均有抑制作用，且随处理时间增加抑制作用增强；不同处理时间之间相对ck1出苗率均具有显著差异(p<0.05)，而相对ck1的成苗率，0.9%EMS处理直立型扁蓿豆发芽种子1h与处理3h、5h有显著差异，处理其3h与5h二者间无显著差异(p<0.05)；0.9%EMS处理直立型扁蓿豆发芽种子3h相对ck1的出苗率为52.55%，接近半致死剂量。一定浓度不同时间的EMS处理相对ck2的出苗率和成苗率均有抑制作用，并随时间增长抑制效果加大；相对ck2的出苗率，同浓度不同处理时间间均有显著差异；不同处理时间相对成苗率(ck2)间的差异显著性与其相对ck1成苗率间一致。

表2 EMS处理直立型扁蓿豆发芽种子的相对出苗及相对成苗率

注：同列具有完全不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下表亦同。

2.3 EMS诱变对直立型扁蓿豆幼苗叶片生长的影响

由表3可知，经EMS处理的直立型扁蓿豆吸胀种子播种成苗的第一片真叶长和宽均显著低于对照(ck1和ck2)，ck1和ck2无显著差异；EMS处理吸胀种子的第二片真叶的长与CK1无显著差异，比ck2平均窄1.09mm，其间存在显著差异(p<0.05)；EMS处理吸胀种子48h第二真叶宽与ck1和ck2均有显著差异。EMS处理发芽种子5h的幼苗生长缓慢，40d时未长出第一片真叶，仍处于双子叶期；EMS处理发芽种子的对照、1h处理的真叶长和宽分别比3h处理平均长3.94mm，2.27mm，且均与3h处理有显著差异(p<0.05)；EMS处理发芽种子3h播种后幼苗的第二片真叶长、宽仍与ck1、ck2及处理1h有显著差异，ck1与ck2间真叶长亦有显著差异。

0.9%EMS处理直立型扁蓿豆吸胀种子48h幼苗生长40d时真叶数目与对照(ck1和ck2)有显著差异(p<0.05)；EMS处理发芽种子3h与对照和1h平均少1-2片叶子，存在显著差异(p<0.05)；EMS处理发芽种子的ck1叶片数目显著少于ck2，可见磷酸缓冲液对叶片生长发育有一定抑制作用。

表3 EMS处理直立型扁蓿豆幼苗40d真叶长宽(mm)及数目

2.4 EMS诱变对直立型扁蓿豆幼苗高度及生长速度的变化

2.4.1 EMS诱变直立型扁蓿豆吸胀种子其幼苗高度及生长速度的变化

如图3所示，EMS处理直立型扁蓿豆吸胀种子后生长的幼苗在第40d的株高显著低于ck1、ck2的幼苗高(p<0.05)；ck1和ck2亦有显著差异(p<0.05)，说明磷酸缓冲液抑制幼苗生长。如图4所示，经EMS处理吸胀种子的幼苗在第30d时生长速度与前期相比有明显的提高，且第40d、50d及60d的生长速度整体较为稳定；EMS处理60d内的生长速度变化率较ck1和ck2均有所增加，其在第30d和40d时与ck1和ck2均有显著差异，而在60d时只与ck2有显著差异(p<0.05)；ck1和ck2在60d内的生长变化率均无显著差异。

图3 第40天幼苗高度

图4 60d内幼苗生长速度变化

2.4.2 EMS诱变直立型扁蓿豆发芽种子其幼苗高度及生长速度的变化

如图5所示，经EMS处理直立型扁蓿豆发芽种子1h其幼苗高度在第40d时比对照偏高，说明一定浓度下短时间的EMS处理对幼苗生长有促进作用；3h处理的苗高显著低于ck1、ck2和1h处理的苗高，可见在EMS处理直立型扁蓿豆发芽种子3h对其生长有明显抑制作用。如图6所示，在幼苗生长的60d内，处理1h、3h时其生长速度均呈先上升后下降的趋势，都在40d时生长速度变化率最大，得知经EMS处理的幼苗在20-40d生长最快；ck1在50d内生长速度较为平稳，第50-60d时幼苗生长缓慢；ck2在20-30d和40-50d时生长速度较快；处理3h在30d、40d、50d时生长速度与ck1、ck2、1h均无显著差异，只在第60d时显著低于ck2(p<0.05)，其余三者间无显著差异。

图5 第40天幼苗高度

图6 60d内幼苗生长速度变化

2.5 EMS诱变直立型扁蓿豆2种萌发阶段种子对其变异率的影响

EMS处理直立型扁蓿豆吸胀种子和发芽种子的幼苗变异率、成活率如表4所示，从表4可以看出EMS处理对幼苗变异率产生一定影响。处理不同状态种子其M1代幼苗在形态上表现各异，详见图7。EMS处理直立型扁蓿豆吸胀种子48h，其幼苗变异率为15.38%，成活率为43.3%；而EMS处理其发芽种子变异率和成活率相对较低，仅为5.29%和9.91%。由此可见，EMS诱变直立型扁蓿豆吸胀种子为较优选择。

表4 EMS处理幼苗的变异率和成活率

A-D为EMS处理吸胀种子幼苗形态变异，A.对照，B.叶量多，C.黄花叶，D.白化叶；a-d为EMS处理发芽种子幼苗形态变异，a.对照，b.生长抑制，c.第二片真叶变异，d.节间处变异。

图7 苗期变异苗类型

3 讨论

3.1 EMS处理直立型扁蓿豆2种萌发阶段种子半致死剂量分析

在EMS诱变育种研究中，需选择合适的诱变剂剂量，以获得较好的诱变效应〔8〕。EMS诱变一般以半致死剂量下的时间和浓度〔9-11〕。EMS诱变处理种子时，诱变浓度越高，处理时间越长，EMS越易溶解产生有机酸，毒害作用越强，会对种子产生严重损伤。在何慧怡〔10〕等人研究发现在处理浓度相同的情况下延长处理时间的伤害要比处理时间相同增加处理浓度的伤害小，所以在选择诱变处理组合的过程中应从延长处理时间以提高诱变效率。本研究中，采用0.9%EMS处理直立型扁蓿豆发芽种子1、3、5h，以相对出苗率的50%为半致死剂量，处理发芽种子3h的相对出苗率为52.55%，接近半致死剂量。乔雨等〔5〕用0.9%EMS对直立型扁蓿豆吸胀种子处理48h，其相对发芽率为49.7%，达半致死剂量。而本试验采用该剂量处理直立型扁蓿豆吸胀种子其相对发芽率仅达37.75%，分析其原因是可能与种子前期处理有关，砂纸打磨力度不同。

3.2 EMS诱变对幼苗外部形态特征的影响

EMS处理后幼苗外部形态特征的变化主要以形态学鉴定法来观察，这是较为直观的方法，在植株的整个生育期都可以用此方法进行判断。夏曾润等〔12〕对紫花苜蓿种子进行诱变，发现变异株株高与对照株相比变化显著，变异株出现矮化，抑制生长等现象；臧辉等〔13〕研究发现EMS诱变处理对羊草幼苗生长有明显的抑制作用，表现为根长、苗长的降低。云娜〔9〕研究得到长时间、高浓度EMS浸种对蒙农红豆草的幼苗生长有明显抑制作用，低浓度的EMS浸种会在一定程度上促进苗高生长。本研究结果表明，0.9%EMS处理直立型扁蓿豆吸胀种子48h对其幼苗形态特征产生了一定的作用，其中经处理后的幼苗生长速度整体高于对照，叶宽、叶长、真叶数及株高均比对照降低；0.9%EMS处理直立型扁蓿豆发芽种子1h对其幼苗生长有一定程度的促进作用，延长处理时间至3h其株高、叶长、叶宽则整体呈降低趋势，并且在40-60d时生长速度明显降低；本试验结果与前人基本保持一致。利用形态学特征鉴定植物是否发生诱变的优点是简便、快速地便可在苗期做出筛选鉴定，大大减轻了育种者的工作量，但是其缺点是存在着很大的经验因素，所以鉴定结果一般仅作为初步判断的结果，要得到比较准确的结论还需进一步更深刻地进行后续阶段突变体库的建立及M2、M3代田间表型观测及细胞学鉴定等。

3.3 EMS诱变对2种萌发阶段种子诱导效率的影响

本试验EMS处理发芽种子变异率为5.29%，成活率为9.91%，均低于EMS处理吸胀种子的变异率及成活率。邱庆树等〔14〕研究中提到诱变发芽期种子，可提高其诱变效果；对于直立型扁蓿豆，李洁〔15〕采用秋水仙素处理直立型扁蓿豆不同萌发阶段种子，研究发现处理胚根长至2-3mm的发芽种子诱导效果最好。这与本试验所得结果存在差异，可能与诱变剂和处理方式有关。

3.4 磷酸缓冲液对幼苗生长的影响

前人EMS诱变处理多选用磷酸缓冲液作为对照〔7,9,12,16〕，本研究在EMS处理直立型扁蓿豆2种萌发阶段种子均设立2个对照，即磷酸缓冲液对照和蒸馏水对照；研究结果显示EMS处理吸胀种子的发芽率及其处理发芽种子的出苗率，磷酸缓冲液与蒸馏水均有显著差异(p<0.05)；EMS处理发芽种子的2个对照在幼苗第二片真叶的长和真叶数上亦有显著差异(p<0.05)；EMS诱变吸胀种子40d时磷酸缓冲液的幼苗高度显著低于蒸馏水(p<0.05)。可见磷酸缓冲液对幼苗的萌发生长有一定程度的抑制作用。

4 结论

0.9%EMS分别处理直立型扁蓿豆发芽种子、吸胀种子48h和3h，其相应幼苗的株高、叶长、叶宽、叶片数整体呈降低趋势；而0.9%EMS处理直立型扁蓿豆发芽种子1h对其幼苗生长有一定程度的促进作用。以EMS半致死剂量下的时间和浓度处理直立型扁蓿豆吸胀种子的变异率、成活率均高于处理其发芽种子，EMS处理吸胀种子为更有效的诱变方式。磷酸缓冲液对幼苗生长有一定抑制作用。