癸氧喹酯干混悬剂含量测定的改进

2019-07-26 07:34:08作者陈创华曾海波潘绮雯刘燕

广东饲料 2019年6期

◆作者：陈创华曾海波潘绮雯＊刘燕

◆单位：广东省农产品质量安全中心

癸氧喹酯是一种非常有效的喹诺酮类畜禽用抗球虫药。在球虫的无性繁殖阶段进入子孢子细胞后，通过干扰DNA合成而阻止其发育，从而避免家禽肠道受到损害。本品吸收快，在一小时内即可达到抗球虫的有效浓度，3天后浓度达到高峰水平，抗球虫指数大于180，属于高效药物。主要用于预防鸡的变位、柔嫩、巨型、堆型、毒害和布氏等引起的球虫病。癸氧喹酯干混悬剂+原属进口药品，在英国有癸氧喹酯预混剂（C24H35NO5,6-癸氧基-7-乙氧基-4-羟基喹啉-3-羧酸乙酯，6-decy-cloxy-7-ethoxy-4-hgdroxyqaindine-3-carboxylate)药品。目前癸氧喹酯溶液含量测定方法的依据为农业部批准的第2035号（3%）和2311号（6%）两个公告中，两个质量标准均各有差异，难以形成统一、稳定、简便、快捷的测试方式。现将两个公告的标准合并，本次参考《中国兽药典》癸氧喹酯预混剂中含量测定方法测定癸氧喹酯干混悬剂的含量，为该制剂的质量控制提供可靠的依据。

1 材料与仪器

高效液相色谱仪Agilent 1100；甲醇（AR）、水（超纯水）、冰醋酸（AR）；规格为6%的癸氧喹酯干混悬剂样品由成都乾坤动物药业股份有限公司、广州华农大实验兽药有限公司、广东大华农动物保健品股份有限公司动物保健品厂提供，规格为3%的癸氧喹酯干混悬剂样品由瑞普（天津）生物药业有限公司提供，辅料由广东大华农动物保健品股份有限公司动物保健品厂提供；癸氧喹酯对准品由中国兽医药品监察所生产，批号为K0651211，含量为99.7%。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件流动相为甲醇-水-冰醋酸（85∶15∶1）

色谱柱，WatersXSelect○RC SHTM-C184.6×150mm，5μm；检测波长，265nm；进样量，10μL；流速，每分钟 1.0mL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

取癸氧喹酯对照品适量，精密称定，置100mL量瓶中，加氯化钙甲醇溶液（取氯化钙1g，加甲醇100mL，超声使溶解）适量，超声15分钟，放冷；用氯化钙甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；滤过，精密量取续滤液5mL，置50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

2.2.2 供试品溶液的制备

取癸氧喹酯干混悬剂适量（约相当于癸氧喹酯50mg），精密量取，置100mL量瓶中，加入氯化钙甲醇溶液适量，超声15分钟，放冷，用氯化钙甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；滤过，精密量取续滤液5mL，置50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

2.3 系统适用性试验

取 50μg/mL的对照品溶液，按2.1项下的色谱条件进样。理论板数按癸氧喹酯峰计算为4904，分离度为 2.4（见下图 1）。

图1 系统适用性试验图

2.4 线性关系

取每1mL中含癸氧喹酯2、10、50、100、250μg 的对照品溶液，按2.1项下的色谱条件进样，记录色谱图，以对照品溶液浓度的对数值与相应的峰面积对数值计算线性回归方程。结果表明，在2～250μg/mL范围内，峰面积的常用对数与进样量浓度的常用对数呈良好的线性关系，标准曲线如下图，回归方程Y=63.821X+6.5379 R2=1(n=5)（见下图2）。

图2 癸氧喹酯标准曲线

2.5 检测限及定量限

按信噪比S/N=3时，癸氧喹酯的检测限为0.5μg/mL；按信噪比S/N=10时，癸氧喹酯的定量限为2.0μg/mL。

2.6 精密度试验

取广东大华农动物保健品股份有限公司动物保健品厂样品6份，每份约0.4g，精密称定后，分别置100mL量瓶中，加入氯化钙甲醇溶液适量，超声15分钟，放冷，用氯化钙甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；滤过，精密量取续滤液5mL，置50mL量瓶中，再分别加入对照品(0.2536mg/mL)各5mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积计算，得日内 RSD (n=6)为0.13%。结果表明本法的精密度良好（见下表1）。

2.7 回收率试验

取已知含量的癸氧喹酯原料 40、50、60mg，按含量规格的80%、100%、120%，模拟制成含癸氧喹酯原料约 4.8%、6%、7.2%浓度的样品各3批，共9批样品，按2.1项下的色谱条件进样，测定峰面积。结果表明回收率在99.24%～99.51%，批间RSD在 0.05%～0.28%之间，n=3（见下表 2）。

2.8 耐用性

取癸氧喹酯对照品溶液，在不同柱温、流速、不同的流动相比例，不同色谱柱及不同的高效液相色谱仪进行测定。

2.8.1 不同柱温

采用安捷伦色谱仪1200，以WatersXSelect○RCSHTM-C18（4.6×150mm，5μm）为色谱柱，流速为1.0mL/min，设定不同柱温对色谱峰的影响。结果显示，不同柱温对主峰影响不大（见下表 3）。

2.8.2不同流速

采用安捷伦色谱仪1200，以WatersXSelect○RCSHTM-C18（4.6×150mm，5μm）为色谱柱，柱温为25℃,设定不同流速对色谱峰的影响。结果显示，流速大于1.0mL/min的主峰出峰时间明显比流速0.8mL/min缩短，但柱效都能满足检测需求（见下表4）。

表1 精密度试验检测结果表

2.8.3 不同流动相比例

采用安捷伦色谱仪1200，以Waters XSelect ○RCSHTM-C18（4.6×150mm，5μm）为色谱柱，柱温为25℃及流速为1.0mL/min,设定不同流动相比例对色谱峰的影响。结果显示，随着甲醇的比例增加，主峰的出峰时间明显缩短，理论塔板数明显下降（见下表 5）。

表2 癸氧喹酯回收率试验检测结果表

2.8.4 不同机型及色谱柱

设柱温为25℃及流速为1.0mL/min,采用不同机型及色谱柱对色谱峰的影响。结果显示，不同的色谱柱及机型均能满足检测需求（见下表6）。

2.9 专属性

取溶剂、厂家提供配方辅料作为基质各适量，精密量取氯化钙甲醇溶液5mL，置50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为溶剂；取a-吡咯烷酮、二甲基亚砜，聚乙二醇400、氯化镁、无水乙醇、吐温-80按广东燕唐药业公司的配方配制成100mL，精密量取2mL，置100mL量瓶中，用氯化钙甲醇溶液稀释至刻度，精密量取5mL，置50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为辅料；按含量的方法测定，在癸氧喹酯相应的保留时间附近均无吸收，结果表明，溶剂和辅料对主成分均无干扰（见下图3-5）。

2.10 稳定性试验

取对照品溶液，按2.1项下的色谱条件进样，测定峰面积，分别在 0、2、4、8、24、48 小时进样，考察其稳定性。结果显示，在48小时内主峰面积RSD仍小于2.0%，该溶液在室温放置48小时内稳定（见下表7）。

图3 溶剂峰图

图4 辅料峰图

图5 癸氧喹酯对照品图

表3 不同柱温试验检测结果表

表4 不同流速试验检测结果表

2.11 样品含量测定

《中华人民共和国兽药典（2015年版）》一部癸氧喹酯预混剂（6%）质量标准和农业部公告第2035号（3%）质量标准的色谱条件与系统适用性试验一致，只是样品稀释后的进样浓度有差别。按照《中华人民共和国兽药典（2015年版）》一部癸氧喹酯预混剂（6%）质量标准检查样品，和按照农业部公告第2311号癸氧喹酯干混悬剂(6%)的质量标准检查样品（见下表8）。

3 小结

3.1 癸氧喹酯干混悬剂标准分别收载于农业部公告2035号（3%）、2311号(6%)两个公告中，其中，农业部公告第2035号（3%）与中华人民共和国兽药典（2015年版）》一部癸氧喹酯预混剂（6%）的质量标准中含量测定的色谱条件与系统适用性试验一致，测定法基本相同，只是进样浓度不同。而农业部公告2311号（6%）的含量测定方法先加三氯甲烷10mL超声处理15分钟后，用氯化钙乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置50mL量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液4mL，用无水乙醇稀释至刻度。此质量标准使用了三氯甲烷有毒有害试剂，毒性大；且操作步骤繁琐复杂。本研究与癸氧喹酯预混剂标准及农业部公告第2035号（3%）的含量测定方法一致，能用于癸氧喹酯干混悬剂及预混剂的含量测定，配制简单方便，并且检测灵敏度高。

3.2 通过本法改良测定癸氧喹酯干混悬剂的含量，灵敏度、稳定性高，且干扰少，回收率高，结果准确，方法可靠，可为其质量控制提供依据。