基于GC-MS和PCA分析黑毛茶高湿霉变过程挥发性组分

胥 伟，姜依何，田双红，朱 旗,*

（1.湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2.四川农业大学园艺学院，四川 成都 611130)

茶树鲜叶经杀青、揉捻、渥堆、干燥等工序制得黑毛茶[1]，生产上再通过不同的精制工艺将其加工成各种类型的黑茶产品，中国茶叶流通协会报道了2017年全国黑茶产量为36.3万 t，占比13.80%，位居六大茶类第2位[2]。由于生产黑茶的鲜叶原料采摘通常较为粗老，加工成的黑毛茶需在库房中存放1～2 a才能进行精制，通过精制和拼配加工成各种黑茶成品[3]。同时，销售后的成品黑茶，民间也有通过存放以改善其口感粗涩的习俗。但在黑毛茶仓储或成品黑茶存放过程中，由于环境条件的变化，特别是在南方的梅雨季节，茶叶表面极易滋生霉菌[4-5]，轻者有风霉味，重者失去饮用价值，甚至产生安全问题。

为了解高湿条件下霉变黑毛茶挥发性组分的变化规律及其呈味特征下的物质基础，本研究人工设定温度和湿度环境促进霉菌在黑毛茶上生长，通过气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法测定市场自然霉变茶样和实验室人工促霉黑毛茶霉变过程中多种挥发性组分并进行了主成分分析，为揭示高湿霉变导致黑毛茶风味劣变的物质基础提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

将来源于黑茶生产企业的黑毛茶（2016年5月产于湖南省桃源县，一级，含水量（10.05±0.20）%）样品盛于培养皿（培养皿开口，每份培养皿15 g茶样，分别置于培养箱内五层栅状隔板上，每层12 份，合计60 份）并置于生化培养箱进行促霉培养。培养条件：温度25 ℃，相对湿度（relative humidity，RH）为90%。人工促霉培养过程中分别按培养至第0、5、7、9、11、13天依照栅状隔板分层取样混匀，-20 ℃密封冻存。从市场收集2 份自然霉变黑茶样品（霉变茯砖茶：ZM1，霉变花卷茶：ZM2）用于霉变茶样挥发性组分的对照分析。

癸酸乙酯标准品 美国Sigma公司；无水硫酸亚铁（分析纯） 长沙隆和化玻实验用品有限公司。无水乙醚为国产分析纯，经实验室重蒸馏后用于挥发性组分的提取。

1.2 仪器与设备

GZ-150-HSII恒温恒湿箱 韶关市广智科技设备有限公司；PB303-N电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；LDP-350型高速多功能粉碎机 浙江永康市红太阳机电有限公司；KQ3200B超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司；98-1-B型电子调温电热套 天津市泰斯特仪器有限公司；QP2010 GC-MS仪 日本岛津公司；同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）装置 天长市华玻实验仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 挥发性组分提取

图1 SDE装置示意图Fig. 1 Schematic diagram of SDE device

采用赵仁亮等[6]的方法。SDE装置见图1，在A瓶（2 000 mL圆底烧瓶）中装入茶样粉末50.0 g和蒸馏水1 000 mL，B瓶（250 mL圆底烧瓶）中装入重蒸好的乙醚60 mL。在A瓶中加入内标癸酸乙酯1 mL（10 mg/mL），用电热恒温套加热A瓶，待A瓶沸腾时开始水浴（50 ℃）加热B瓶，蒸馏萃取45 min（B瓶沸腾时开始计时）。收集萃取液及装置中央上层的乙醚，于-20 ℃冰箱中静置过夜后过滤，滤液用液氮氮吹浓缩至1.0 mL，毛细管迅速转移至1.5 mL玻璃样品瓶中待GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS分析[7]

GC条件：DB-5MS石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为氦气（纯度＞99.999%）；进样口温度210 ℃；柱流量1.0 mL/min，进样量1 μL；分流比10∶1。程序升温：初始温度为50 ℃，保持4 min；以2 ℃/min升温至150 ℃，保持1 min；以5 ℃/min升温至180 ℃，保持5 min；以10 ℃/min升温至280 ℃，保持20 min。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度200 ℃；接口温度220 ℃；质量扫描范围35～500 u；溶剂延滞时间2.8 min；扫描方式Scan。

1.3.3 定性和定量分析

挥发性组分的定性分析采用相关文献[8-11]及检索NIST谱库的方法进行匹配，归纳整理相似指数大于800的化合物[12]。采用峰面积归一化法进行相对定量分析[13]，得出相对丰度后进行内标组分值样品间调平，得出相对定量值。

1.4 数据处理

采用Excel 2010对数据进行做图，采用SPSS 22.0进行主成分分析[14]。采用在线软件绘制韦恩图（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）。

2 结果与分析

2.1 霉变黑茶样品的各类挥发性组分存在状态

图2 黑毛茶霉变外观及体式显微镜检图Fig. 2 Visual appearance and stereomicroscope observation of mildewed raw dark tea

如图2所示，随着高湿条件培养时间延长，黑毛茶表面霉变程度逐步加深，体式显微观察表明在霉变初期肉眼无法观察到霉变表征时，霉菌菌丝已开始在黑毛茶表面生长。通过对不同样品间各类挥发性组分的汇总发现，人工霉变样品和自然霉变样品以酸类、醇类、酯类、醛类、酮类和烷类挥发性组分为主，其中酸类挥发性组分相对含量在霉变过程中呈上升趋势。这与霉变黑茶审评出现风霉味或有相关性。

2.2 霉变黑茶样品的挥发性组分分析

从不同人工霉变程度的样品中和自然霉变的样品中共检测出65 种香气成分（图3、4，表1）。人工霉变样品以酸类、醇类、酯类和烷类4 类挥发性组分为主，自然霉变茯砖茶样品以酸类、醇类、醛类和酯类4 类挥发性为主，自然霉变花卷茶样品以醛类、酸类、酮类和醇类4 类挥发性组分为主。23 种单体组分在所有霉变黑茶样本中检出，38 种共有单体组分在人工霉变样品中检出，43 种共有单体组分在自然霉变样品中检出（图5）。

图3 霉变黑茶挥发性组分种类及相对定量值Fig. 3 Kinds and relative contents of volatile compounds identified in mildewed dark tea

图5 基于不同黑茶霉变样本的差异香气韦恩图Fig. 5 Venn diagram showing aroma difference among different mildewed dark tea samples

在人工促霉样品中未霉变起始样品挥发性组分相对含量排前4 位的分别为：棕榈酸、叶绿醇、亚麻酸甲酯、六氢法呢基丙酮；霉变第5天挥发性组分相对含量排前4 位的分别为：叶绿醇、棕榈酸、亚麻酸甲酯、亚油酸；霉变第7天挥发性组分相对含量排前4 位的分别为：叶绿醇、棕榈酸、亚麻酸甲酯、六氢法呢基丙酮；霉变第9天挥发性组分相对含量排前4 位的分别为：棕榈、叶绿醇、六氢法呢基丙酮、α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]环氧乙烷甲醇；霉变第11天挥发性组分相对含量排前4 位的分别为：棕榈酸、叶绿醇、亚麻酸甲酯、亚油酸；霉变第13天挥发性组分相对含量排前4 位的分别为：棕榈酸、叶绿醇、亚麻酸甲酯、油酸；自然霉变茯砖茶挥发性组分相对含量排前4 位的分别为：棕榈酸、2-己烯醛、正己醛、叶绿醇；自然霉变花卷茶挥发性组分相对含量排前4 位的分别为：棕榈酸、正己醛、3-醇-1-戊烯、六氢法呢基丙酮。

表1 霉变黑茶样品主要香气成分组成及相对含量Table 1 Main aromatic components and relative contents in mildewed dark tea

续表1

图6 部分挥发性单体在霉变过程的动态变化图Fig. 6 Dynamic changes of some volatile monomers during mildewing process

上述表明，棕榈酸为黑茶的主体香气组分，这与赵仁亮[6]、陆英[15]等的研究结果相一致，并认为其对茶叶香气的贡献不大。在黑毛茶样品中除棕榈酸外，叶绿醇、亚麻酸甲酯、六氢法呢基丙酮、亚油酸等为其主要香气。从图6可以看出，多数在黑毛茶样品中相对含量较高的挥发性组分随霉变的过程呈下降的趋势，如：β-二氢紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、5,6-环氧-β-紫罗兰酮、六氢法呢基丙酮、芳樟醇、脱氢芳樟醇、二氢猕猴桃内酯；而壬醛、角鲨烯和蘑菇醇相对含量则随着霉变时间的延长而呈现增长的趋势，有研究表明蘑菇醇是一类带有泥土气味或蘑菇味的香气物质，这与审评感官风霉味的呈现存在相关性，而角鲨烯起初从角鲨的肝中分离出[16]，后有研究从真菌的菌体中亦可分离出该类物质[17]，这可能是导致霉变黑毛茶角鲨烯相对含量上升的原因。壬醛、蘑菇醇及角鲨烯是黑毛茶霉变过程风味劣变的主要因素，这与赵泽伟等[18]在研究薏米仁储存过程风味物质变化规律相类似。

2.3 霉变黑毛茶的主成分分析

本实验从6 个人工促霉的黑毛茶样品中共检出38 种共有的挥发性成分，以38 种共有的挥发性成分的相对含量构成的6×38的矩阵，利用SPSS软件（22.0版本）进行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，结果见表2、3。第1主成分方差贡献率为60.401%，其中壬醛、六氢法呢基丙酮、2,3-辛二酮、2-乙基己醇、3,7,11-三甲基-1-十二烷醇、β-环柠檬醛、长叶烯、叶绿醇、棕榈酸甲酯、芳樟醇、邻苯二甲酸二异丁酯、正辛醛、蘑菇醇、α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]环氧乙烷甲醇、棕榈酸、β-紫罗兰酮、油酸、十六甲基环八硅氧烷、异植醇、硬脂酸和雪松醇贡献最大，对应的特征向量均大于0.800。第1主成分数据表明醛类、酮类和醇类是与黑毛茶霉变相关性系数最高的成分，是霉变黑毛茶的主体特征性挥发性组分，如叶绿醇、异植醇广泛存在于黑茶样本中[19-20]，是黑茶的挥发性组分主体组成部分。在香气感官方面，由于阈值的存在，有研究表明，对黑茶起主要作用的香气成分为醇类、醛类等物质[21]。第1主成分中体现出的是壬醛的油哈味[22-23]，蘑菇醇的泥土味或蘑菇味[23]。第2主成分方差贡献率为18.875%，三氯甲烷、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和十八甲基环九硅氧烷贡献最大，对应的特征向量分别为0.972、0.868和0.820，三氯甲烷、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚具有特殊的甜味及稀溶液苯酚的甜味，由于饱和烷烃类物质感觉阈值高，一般不易引起明显嗅感[24]，因此第2主成分主要反映霉变黑毛茶的有机挥发性甜味，该味道起修饰作用。由于在茶叶香气成分中尚未有报道检出该类成分，考虑存在原因在于实验过程中吸附了异味导致；第3主成分方差贡献率为13.500%，环氧芳樟醇的贡献率最大，对应的特征向量为0.960；环氧芳樟醇具有木香[25]，故第3主成分主要反映霉变黑毛茶的木香，对主体香气成分起修饰作用；3 个主成分方差累计贡献率达到92.777%，可反映霉变黑毛茶的总体情况。

表2 主成分分析特征值Table 2 Eigenvalues of principal component analysis

表3 主成分分析的特征向量Table 3 Eigenvectors of principal component analysis

图7 霉变黑毛茶挥发性组分主成分分析载荷图Fig. 7 PCA loading plot of volatile components in mildewed raw dark tea

结合表3和图7可以看出，黑毛茶霉变期间的挥发性化合物的主成分分析中蘑菇醇、异植醇、叶绿醇、2,3-辛二酮、硬脂酸、壬醛、长叶烯、邻苯二甲酸二异丁酯、β-环柠檬醛、2,6-二甲基环己醇、芳樟醇与第1主成分高度正相关，因子载荷系数较大。由于醇类物质的感官阈值较大[26]，在感官上通常表现不明显，醛类物质通常阈值较低，对样品整体风味贡献大[27]。由于第1主成分的方差贡献率为60.401%，能够概括大部分的霉变黑毛茶风味化合物信息，综合第2、3主成分的相关信息的呈味特性，从主成分分析的角度可以剖析出霉变黑毛茶呈味特性表现出以油哈味及泥土味为主，类似有机化学试剂甜香修饰，略带木香的品质风格。

3 讨 论

黑茶品质化学多集中于品质形成机理研究，鲜见于高湿霉变导致黑茶品质劣变的品质化学研究。本实验从高湿条件下诱导黑毛茶的霉变过程着手，针对梅雨季节的气象条件，研究霉变黑毛茶的挥发性组分变化规律。

利用GC-MS测试技术结合主成分分析方法，对霉变黑毛茶挥发性成分含量变化进行研究得出，人工霉变样品中共鉴定出38 种挥发性化合物，对霉变期间挥发性组分进行统计分析，可以发现组分丰度贡献最大的挥发性组分为醇类、醛类及酸类；通过对单一组分分析，结果显示大部分带有花香或果香的挥发性组分呈现降低的趋势，而表现为变现为油哈味的壬醛[18]，蘑菇味（或称泥土味）的蘑菇醇[28]和具有生物活性功能的角鲨烯[29]呈上升的趋势。进一步通过主成分分析，推断蘑菇醇、异植醇、叶绿醇、2,3-辛二酮、硬脂酸、壬醛、长叶烯、邻苯二甲酸二异丁酯、β-环柠檬醛、2,6-二甲基环己醇、芳樟醇与主成分1高度正相关，是反映霉变黑毛茶的特征性挥发性组分。

在针对成熟度较高的茯砖茶原料的挥发性组分研究显示，其香气类型主要以醇类、酯类和碳氢化合物为主，酸类、苯类及醛类物质相对含量也较高，这与本研究的未霉变样品的香气数据规律一致。而在霉变样品中，发现赋予茯砖茶浓郁花果香的萜烯类物质[8]含量较低，而导致霉变黑毛茶的内含物质酸败的酸类及醇类物质含量较大。表明在黑毛茶霉变过程中，高湿条件及微生物的作用诱导醇及酸类物质的产生，对黑茶品质带来不利的影响。这也与杨蕾[30]在研究烟草高湿霉变条件下挥发性组分变化规律相一致。由于样本量的受限，表征霉变黑茶风霉味的化学本质有待进一步研究。