单核细胞亚群在急性ST段抬高型心肌梗死中的分布及其炎性细胞因子的分泌特性

苏福娣 李 彪 何 芸 曾建平

1.广州市红十字会医院心血管内科，广东 广州 510240 ；2.广东祈福医院肿瘤科，广东 广州 510220

近年研究认为急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后过度的炎症反应引起心肌细胞及其间质形态结构的改变，是心梗后心室重塑及心力衰竭的重要因素。大量研究表明单核细胞在炎症反应中具有促炎与抗炎的双重作用，且不同亚群的单核细胞在促炎与抗炎方面的作用表现不同[1]。在2010年公布单核细胞命名共识中，单核细胞被分为三个亚群[2]Mon1、Mon2、Mon3。有关AMI中单核细胞亚群分布的国内外研究中，多数研究观察到以Mon2升高最为明显[3]，但部分研究显示AMI后Mon1升高更为显著[4]。关于AMI中各型单核细胞的促炎性/抗炎性功能的研究甚少，本研究通过观察STEMI患者中单核细胞的亚群分布、检测各亚群单核细胞分泌TNF-α、IL-1β的特点，探讨单核细胞亚群与STEMI后炎症反应、损伤修复、心室重构的相关性。

1 资料和方法

1.1研究对象 收集2016年1月至2017年6月起病24 h内就诊于我院的STEMI并在我院行急诊PCI治疗患者32例，诊断符合2015年中华医学会心血管分会STEMI诊断和治疗指南中诊断标准[5]。同时排除以下合并症者：①先天性心脏病；②瓣膜性心脏病；③心肌病；④NYHA分级Ⅲ、Ⅳ级的慢性心力衰竭；⑤肝脑肾重要器官功能衰竭的；⑥血液系统疾病；⑦自身免疫、结缔组织性疾病；⑧合并感染、肿瘤、及长期使用免疫抑制剂。

入选STEMI组中男22例女性10例，平均年龄(62.5±8.4)岁；对照组男14例，女6例，平均年龄(59.5±9.2)岁，两组年龄及性别构成比无统计学意义。

1.2采集信息 STEMI组术后第二天清晨用EDTA管采集静脉血5 ml。检测外周血白细胞、单核细胞计数。

1.3主要试剂与设备 PE-CD14单克隆抗体、PE-mouseIgG2a、APC-CD16单克隆抗体、APC- mouse IgG1(CA BioLegend公司)。FITC-CD45单克隆抗体、FITC-mouse IgG1(美国BD Biosciences公司)。IL-1β ELISA、TNF-α ELISA试剂盒(欣博盛生物工程有限公司)。流式细胞分选仪(美国Becton Dickinson公司)。96孔细胞培养板(美国Corning costar公司)。

1.4流式细胞术检测

1.4.1分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC) 用EDTA抗凝管采集空腹外周静脉血4 ml，离心后去血浆后以1∶1加入含淋巴细胞分离液的离心管中，1800 rpm离心15 min，吸取白膜层即淋巴细胞层后余液转移至新离心管中，再加入PBS，1800 rpm离心12 min后弃上清液再加入PBS混匀后1800 rpm再离心10 min，沉淀细胞团即为PBMC。

1.4.2单核细胞亚群计数 流式管中加入100 μl去血浆后的外周血，分别加入FITC-CD45单克隆抗体和PE-CD14单克隆抗体以及APC-CD16单克隆抗体各5 μl，分别以FITC-mouse IgG1、PE-mouseIgG2a、APC- mouse IgG1作为同型对照抗体。室温避光孵育20 min，每管加入1 ml溶血素室温静置10 min，每管加入PBS 1ml，1800 rpm离心10 min，再以PBS3 ml洗涤两遍，1500 rpm离心10 min，弃上清，加入1%多聚甲醛400 μl重悬固定，4 ℃避光保存至上机检测。采用Flowjo软件处理数据，在CD45-侧向散射光(SSC)点图上选定单核细胞群，测定各单核细胞亚群比例。

1.4.3单核细胞亚群的分选和体外培养 往PBMC中分别加入PE-CD14单克隆抗体、APC-CD16单克隆抗体、和FITC-CD45单克隆抗体各5 μl。震荡混匀，孵育20 min，每管洗涤两遍，1500 rpm离心10 min，洗去未结合抗体后上机分选，在CD45-侧向散射光(SSC) 点图上分别选定各单核细胞亚群。用RPMI-1640培养体系重悬各单核细胞亚群。将分选得到的各单核细胞亚群种于96孔板，浓度5×104/ 100 U，各亚群均设有复孔。每孔加入LPS 1ug/ml，5%CO2条件下37 ℃培养24 h，培养液1800 rpm离心10 min，上清液存储于-20 ℃冰箱，待测炎症细胞因子浓度。

1.5IL-1β和TNF-α 检测按ELISA试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1外周血单核细胞 与对照组比较，STEMI组单核细胞具体数值的增多差异无统计学意义；单核细胞在白细胞中的占比显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 外周血单核细胞总数及其在白细胞中占比

2.2外周血单核细胞亚群分布 与对照组比较，STEMI组Mon3出现明星扩增(t=5.977，P=0.0072)，Mon2比例亦明显升高(t=3.676，P=0.0084)，Mon1比例明显减少(t=-5.753，P=0.001)，见表2。

表2 外周血单核细胞亚群分布

2.3血浆中IL-1β和TNF-α的水平 实验发现与对照组相比，STEMI组血浆的IL-1β[10.89(0.76～34.38)pg/ml vs 1.32(0.06～4.58) pg/ml，t=8.453，P<0.01]和TNF-α[22.4(1.58～47.52)pg/ml vs 5.62(0.58～9.62)pg/ml，t=15.68，P<0.01]水平均明显升高，差异有统计学意义。

2.4单核细胞亚群分泌促炎症细胞因子的功能 检测单核细胞培养上清促炎症细胞因子，STEMI患者的Mon2分泌IL-1β和TNF-α较Mon1和Mon3明星升高(P<0.01)。见表3。

表3 STEMI各单核细胞亚群炎症细胞因子分泌功能

3 讨 论

近年研究[6-8]表明，单核细胞是促进炎性损伤的主要因素，也是拮抗炎症反应和参与组织修复的重要因素，其抗炎和促炎性作用取决于其单核细胞亚群的分布。在关于AMI中单核细胞亚群分布的国内外研究中，多数研究观察到以Mon2升高最为明显[3]，但仍有部分研究显示AMI后Mon1升高更为显著[4]。

本研究发现STEMI患者急诊PCI术后第二天单核细胞在白细胞中的比例增加，同时STEMI患者急诊PCI术后第二天Mon3、Mon2出现明星扩增，Mon1比例明显减少，提示急性心肌梗死早期，单核细胞亚群中以Mon3增加最为显著，其次为Mon2，而Mon1扩增最少。2011年Luke D Tapp等研究[3]发现STEMI早期以Mon2升高为主，其次是Mon1而Mon3则无明显增加，与本研究结果存在差异。

本研究发现STEMI患者早期外周血中炎症因子IL-1β和TNF-α水平明显升高；同时各亚群单核细胞培养证实Mon2分泌IL-1β和TNF-α能力较Mon3和Mon1强。该结果与国外Rossol等[9]及Cros等[10]的研究基本一致。提示急性心肌梗死后早期的炎症反应可能通过Mon2途径激活和/或加强，为今后急性心肌梗死后心肌局部和全身炎症反应的研究提供思路。

该研究样本量小，为单一横断面研究，没有多时间点动态观察外周血单核细胞各亚群的变化及其炎症因子分泌功能。今后我们将增加样本同时设置多个观察时间点进行观察，动态观察单核细胞各亚群分布及其与炎症反应的关系。