一种新型的大鼠血浆中阿霉素含量测定方法

高 飞 姬东生 刘 平 陈娜娜 张梦潇 赵 静 肖玉良#

1.药学院，山东第一医科大学(山东省医科院) ，山东 泰安 271000； 2.山东省泰山疗养院，山东 泰安 271000

阿霉素(Doxorubicin，Dox)又名多柔比星，是一种蒽环类糖苷化合物，临床上多用其盐酸盐。阿霉素主要通过嵌入DNA抑制核酸的合成，起到杀灭细胞的效果[1-2]。Dox是一类广谱的抗肿瘤药物，临床上被广泛用于治疗急性白血病[3]、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤[4]、乳腺癌[5]、肺癌[6]、卵巢癌[7]、胃癌[8]、肝癌等多种恶性肿瘤[9]。Dox的主要不良反应常表现为心脏毒性、骨髓毒性、抑制免疫功能以及恶心、呕吐等[10-11]。因其不良反应较大，临床上多将其作为二线药物。硫酸软骨素(CS)具有抗氧化[12]、抗炎[13]、抗动脉粥样硬化[14]、抗肿瘤[15]等药理活性，目前用于防治心脑血管疾病、骨关节炎、神经保护等。我们采用CS修饰Dox可以赋予Dox良好的肿瘤靶向性，提高Dox的靶向性和生物利用度，在降低其不良反应的同时增强了Dox的抗肿瘤效果。药典中Dox的测量采用高效液相色谱法[16]，硫酸软骨素是一种自然界中存在的粘性多糖，脂溶性差，采用液相色谱法测定硫酸软骨素-阿霉素(CS-Dox)可能会造成液相色谱柱的堵塞，影响实验结果。因此如何建立一种能够快速且准确的测定血液中Dox及CS-Dox含量的方法是研究考察Dox和CS-Dox药代动力学及组织分布等相关实验的关键所在。 Dox自身具有较强的荧光，而且其荧光特性比较稳定，本研究采用荧光分光光度法测定大鼠血浆中的Dox及CS-Dox，建立了一种快速、简便、灵敏的定量测定大鼠血浆中Dox及CS-Dox含量的方法。

1 材料与仪器

1.1材料

猪CS 111014-01(Mw=17.5 kDa，华懋双汇实业(集团)有限公司生物化学制药厂)；低分子量猪(Mw=4.1 kDa，自制)；Dox·HCl(97%，北京偶合试剂有限公司)，CS-Dox(自制)，乙二胺四乙酸二钠(分析纯，国药试剂有限公司)。其他试剂均为国产分析纯。

1.2实验仪器

Cary Eclipse荧光分光光度计(美国Varian公司)，TF-FD-1冷冻干燥机(上海田枫实业有限公司)，Vortex QL-902涡旋仪(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.3实验动物

SD大鼠(雄性，200±20 g)，购买于济南朋悦实验动物繁育有限公司。(许可证号：SCXK(鲁)2014-0007)

2 实验方法

2.1检测条件的选择

选用荧光分光光度法测量血浆中Dox的含量。Ex 480 nm，Em 500～800 nm扫描，可以得到在Em 593 nm处有较高峰，故本实验检测条件选用Ex 480 nm，Em 593 nm，激发与发射狭缝均设定为10 nm。

2.2空白血浆样品的采集

实验前SD大鼠禁食不禁水12 h，实验大鼠乙醚麻醉，眼内眦取血，采集的空白血液标本放入到装有EDTA二钠的离心管中，3000 r/min离心10 min，取上清，即得空白血浆样品。

2.3Dox溶液的配制

精密称取Dox·HCl 1.25 mg加水定容到25 ml的容量瓶中，配制50 μg/ml的Dox溶液作为储备液。精密吸取储备液(0.04 ml、0.10 ml、0.20 ml、0.40 ml、1.00 ml、2.00 ml、4.00 ml、6.00 ml)放入10 ml容量瓶中加水定容，配制相应浓度(0.2 μg/ml、0.5 μg/ml、1、2 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml)的Dox溶液，4 ℃避光保存待用。

2.4Dox标准曲线的绘制

精密吸取8份大鼠空白血浆200 μl放入1.5 ml离心管中，每个离心管中分别加入不同浓度的盐Dox溶液200 μl，涡旋混匀，使得血浆中Dox的浓度分别为0.1 μg/ml、0.25 μg/ml、0.50 μg/ml、1.00 μg/ml、2.00 μg/ml、5.00 μg/ml、10.00 μg/ml、15.00 μg/ml。在2.1中的检测条件下测定荧光强度值。以溶液浓度为横坐标，最终荧光强度值(Y)为纵坐标，绘出其荧光标准曲线并求得工作曲线的回归方程。

2.5精密度实验

取大鼠空白血浆200 μl，1∶1加入低、中、高三种浓度的Dox溶液，配制Dox浓度分别为0.25 μg/ml、5.00 μg/ml、15.00 μg/ml的血浆样品。将血浆样品按2.4中的处理方法处理测定其荧光强度，每3 h测定1次，测3次,计算日内精密度，连续测量三天，计算日间精密度。

2.6专属性实验

分别取大鼠空白血浆、Dox水溶液和Dox血浆溶液进行在激发波长540 nm下，扫描400～500 nm的发射波长图谱。比较三者间的大小关系。

2.7回收率实验

在大鼠空白血浆中分别加入低、中、高三个浓度的Dox储备液,使血浆中药物浓度分别为0.25 μg/ml、5.00 μg/ml、15.00 μg/ml,按2.4中的处理方法处理血样并进行荧光测定。将Dox储备液经适当稀释后作对照进行测定,将二者结果进行比较计算提取回收率。

3 结果与讨论

3.1标准曲线的绘制

将配制一系列标准溶液放入荧光分光光度计中测量得到593 nm处的荧光强度值，以溶液浓度为横坐标，最终荧光强度值(Y)为纵坐标，绘出其荧光标准曲线(见图1)，并求得工作曲线的回归方程：Y=16.944X+0.6796(R2=0.9997)。结果表明，Dox在0.1～15 μg/ml的浓度范围内，荧光强度值与浓度线性关系良好。

图1 Dox血浆标准曲线

3.2精密度试验

3.2.1日内精密度 Dox的日内精密度见表1。从表中可知阿霉素血浆溶液日内RSD值小于3%，表示该检测方法测定的日内精密度良好。

表1 Dox血浆溶液日内精密度

3.2.2日间精密度 Dox的日间精密度见表2。从表中可知，Dox血浆溶液日间RSD值小于3%，表示该检测方法测定的日间精密度良好。

表2 Dox血浆溶液日间精密度

3.3专属性实验

对空白血浆、Dox水溶液和Dox血浆溶液进行荧光发射图谱扫描，扫描结果如图2，从图中我们可以看出，5 μg/ml Dox血浆溶液的荧光发射图谱与5μg/ml Dox血浆溶液水溶液的荧光发射图谱，基本重合，说明方法可行。血浆中Dox稳定存在，荧光图谱为Dox专属。

图 2 Dox专属性实验

3.4回收率实验

Dox回收率见表3，从表中可知，Dox的提取回收率均大于84%，RSD小于2.5%，表明该检测方法回收率良好，符合要求。

表3 Dox血浆溶液回收率

3.5CS-Dox回收率实验

CS-Dox回收率见表4，从表中可知，CS-Dox的提取回收率均大于84%，RSD小于1.2%，表明该检测方法回收率良好，符合要求。

表4 CS-Dox血浆溶液回收率

本实验所建立的大鼠血浆中Dox的测定方法，经过方法学确证，在0.1～15.0 μg/ml的范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.9997。该方法的日内精密度和日间精密度的 RSD 均小于2.5%，专属性良好，Dox和CS-Dox提取回收率均大于84%，回收率较高；基本满足Dox和CS-Dox在大鼠血浆中药物浓度检测的需要，同时为Dox和CS-Dox大鼠药代动力学研究提供了可靠的分析方法。