miRNA-23a表达与晚期乳腺癌全切除术后的预后关系分析

张 兰 崔利民 付 倩 张文涛 金 焰 霍彦平

乳腺癌是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的恶性肿瘤[1]。目前，全切除术是晚期乳腺癌常见的外科手术，可有效的切除患者的肿瘤组织，抑制癌细胞扩散。但术后仍有部分患者病情恶化而出现复发转移，故此其预后评估也逐渐受到关注和重视[2]。有研究显示，miRNA是1种小分子的单链非编码RNA，在调节细胞增殖、存活、肿瘤血管生成、入侵和转移中具有重要作用，其中miRNA-23a表达在乳腺癌的转移复发中存在异常，但其机制尚不明确[3-4]。对此，本研究通过检测晚期乳腺癌全切除术后患者的miRNA-23a表达，探讨其与晚期乳腺癌全切除术后患者的预后关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年3月至2017年3月本院晚期乳腺癌全切除术后患者160例，纳入标准：①经临床症状、实验室、影像学等检查证实为乳腺癌[5]；②就诊前1个月无免疫、放化疗、抗感染等治疗史；③无精神病病史；④患者或家属签署知情同意书；排除标准：①妊娠及哺乳特殊人群；②血液性疾病；③有心、肝、肾等严重性疾病；④拒绝或终止本次研究者。其中年龄30～68岁，平均年龄(48.52±17.53)岁，体质量指数(BMI)(19.06～30.40)kg/m2，平均BMI(24.21±4.06)kg/m2，肿瘤类型：导管癌18例，小叶癌15例，腺癌伴粉刺样癌12例，其他类型6例，同期选取健康人员160例，年龄26～72岁，平均年龄(48.53±17.55)岁，BMI(19.06～30.13)kg/m2，平均BMI(24.22±4.08)kg/m2，为本院体检中心经健康体检合格的正常人，辅助检查中血、尿常规检查，血清肝、肾功能生化指标，相关激素的标记免疫分析指标均在正常范围，无心、肺、肾等器官器质性病变，本次研究已经我院伦理委员会审批且通过，两组比较无显著差异(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

血清抽取：给予所有患者术前(出院日)、术后及健康人员晨起空腹抽取上臂静脉血3 ml于无菌试管中，室温静置30 min，待血液自然凝固后3 500 r/min离心 10 min，收集上层血清，标本置-80 ℃ 保存。总RNA提取：按照总RNA提取试剂(北京Tiangen公司)的说明书提取，水溶解后采用分光光度计测定RNA的浓度和纯度，待吸光度(A260/280nm)位于1.8～2.1之间可用于后续逆转录。逆转录：按逆转录试剂盒说明书操作对miRNA-23a进行逆转录反应，miRNA-23a茎环逆转录反应引物为：5'-CGTCGCTACATCCAG7rrGAG-CATATGCGACGCTrC-CAGT-3'，由上海生工生物工程有限公司负责设计合成。反应条件：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 10 min。反应产物置于-20 ℃保存。实时荧光定量PCR：应用SYBR Green FQ-PCR试剂盒(Applied Biosystems公司)进行检测。miR-23a：上游引物(F)：5'-，ITIHCAGACCCCAGGCAG-GCACA-3'，下游引物(R)：5'-TCCATCAGCGTCAA-CACCATCA-3'；本实验设置复孔3个，采用u6基因作为内参，每个样品测定3次，miRNA表达量变化采用与u6基因循环阈值比较进行确定，U6 F：5'-GCGCGTCGTGAAGCGTYC-3'，R：5'-GTGCAGGGT-CCGAGGT-3'。PCR循环参数:95 ℃ 3 min，95 ℃12 s，62 ℃40 s，共40个循环。

1.3 观察指标和标准

在62 ℃采集荧光信号，并用荧光定量PCR仪自带软件进行熔解曲线分析，miR-23a的相对表达水平以2-ΔCt法计算，公式：ΔCt =[(样本CtmiRNA-23-样本CtU6)。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 所有研究对象的血清miRNA-23a表达量比较

患者术后血清miRNA-23a表达量明显低于健康人员，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 所有研究对象的血清miRNA-23a表达量比较

2.2 乳腺癌术前、术后患者血清miRNA-23a表达量比较

患者术后血清miRNA-23a表达量明显高于术前，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 乳腺癌术前、术后患者血清miRNA-23a表达量比较

2.3 乳腺癌术后复发转移血清miRNA-23a表达量及变化量比较

随访12个月后发现乳腺癌术后复发转移有50例，无复发转移110例，同时在术后3、6、9、12个月血清miRNA-23a表达量及变化量方面，复发转移者明显低于无复发转移者，复发转移者术后呈持续下降的趋势，无复发转移者术后呈持续升高的趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.4 miRNA-23a与乳腺癌术后复发转移的Logistic回归性分析结果

Logistic回归性分析结果显示，血清miRNA-23a表达变化量<20%是患者复发转移的独立影响因素(P<0.05)，见表4。

组别例数3个月6个月9个月12个月变化量/%复发转移者500.48±0.120.41±0.130.35±0.100.29±0.09-7.21±0.02无复发转移者1100.58±0.200.95±0.331.22±0.231.65±0.4231.56±0.12t3.27411.16825.63422.6252266.504P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

表4 miRNA-23a与乳腺癌术后复发转移的Logistic回归性分析结果

3 讨论

乳腺癌是发生在女性乳腺上皮组织的恶性肿瘤，随着近年来生活节奏的加快和医学知识的匮乏导致该发病率有明显上升的趋势，已成为当前社会的重大公共卫生问题，多数患者被确诊时已是晚期状态，严重危及患者的身体健康[6-7]。目前，临床主要通过全切除术治疗晚期乳腺癌，可有效切除肿瘤组织，控制癌细胞扩散，改善患者病情[8]。但有研究显示，多数晚期乳腺癌患者的乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，游离机体后易造成其他病变，从而引起病情复发转移，故如何针对性确保患者术后预后转归有价值的指标具有重要的临床意义[9]。

据相关研究报道，miRNA是1类短序列、非编码的单链小分子RNA，通过碱基配对识别靶mRNA，引发靶基因的降解或者抑制其翻译，从而在转录后水平负调控靶基因的表达，与癌组织的发生发展、侵袭和转移有关[10]。其中miRNA-23a是存在脊椎动物的基因组中的1种抑癌因子，可参与基因转录后表达调控，从而抑制肿瘤细胞增殖、侵袭，其表达量在晚期乳腺癌的诊断及预后评估中具有重要的参考价值[11]。

对此，本研究通过检测所有研究对象的血清miRNA-23a表达量，结果发现患者血清miRNA-23a表达量明显低于健康人员，此与Zhu等[12]的研究结果基本相同，表明血清miRNA-23a表达量与晚期乳腺癌的病理发展有密切关系。这可能由于随着乳腺癌患者病情的恶化，导致体内的癌细胞严重扩散，从而使miRNA对靶基因的降解或者抑制其翻译的负性调控能力降低，继而降低miRNA-23a发挥调节正常细胞增殖的能力。同时本研究中，患者术后血清miRNA-23a表达量明显高于术前(出院日)，此与Shaker等[13]的研究结果基本相同，表明晚期乳腺癌患者行全切除术可有效改善血清miRNA-23a表达量。这有可能由于通过全切除术可有效的切除肿瘤组织，遏止癌细胞的扩散，从而恢复miRNA对靶基因的正常调控，促进miRNA-23a的表达趋于平衡。此外，两组术后患者均有复发转移，且在术后3、6、9、12个月血清miRNA-23a表达量及变化量方面，复发转移者明显低于无复发转移者，复发转移者术后呈持续下降的趋势，无复发转移者术后呈持续升高的趋势，此与胡聂等[14]的研究结果基本相同，表明血清miRNA-23a表达量变化与患者术后的发转移有关。这有可能由于部分患者术后的癌组织无法被抑制杀死，且随着病情的发展会加剧扩散分化，进一步侵袭miRNA-23a，使其参与的基因转录后表达调控失衡，从而使miRNA-23a的表达量降低。同时，本研究的Logistic回归性分析结果显示，血清miRNA-23a表达变化量<20%是患者复发转移的独立影响因素，此与Kleivi等[15]的研究结果基本相同，表明miRNA-23a的表达量可作为晚期乳腺癌患者术后复发转移的评估因子，故术后监测miRNA-23a的表达量对患者的复发转移有重要意义，若术后患者的miRNA-23a的表达量明显降低，应及时检查预防，确保病情稳定。

综上所述，miRNA-23a与晚期乳腺癌的发生及其全切除术后预后转归有关，术后监测血清miRNA-23a表达量可作为评估患者预后的重要指标。