广西地方葛根种质资源遗传多样性的SCoT分析

尚小红 严华兵 曹 升 肖 亮王 艳 欧昆鹏,*

(1 广西壮族自治区农业科学院经济作物研究所，广西 南宁 530007；2 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西 南宁 530007)

葛根(PuerariaDC.)为豆科多年生植物，是国家卫生部首批公布的药食同源植物，享有“北参南葛”、“亚洲人参”的美誉[1]。葛根含有葛根素、黄酮、多糖等多种药用成分，具有生津止渴、解表退热、止泻等功效[2]，且具有维护心血管系统、抗癌、降血糖等多种药理活性[3]。此外，葛根还富含淀粉，可作为非粮生物质新能源，具有巨大的开发潜力。葛根是广西传统种植的农作物，种质资源丰富且具有一定的种植规模。其中，广西梧州市藤县和平镇是中国著名的“葛根之乡”，目前葛根种植面积占全国的20%，是当地农民的主要经济收入来源和增收渠道[4-5]。同时，广西野生葛根资源在各市县均有广泛分布，但因过度采挖导致流失严重。因此，开展广西葛根种质资源收集、遗传多样性评价及利用，对于推动葛根产业的可持续发展具有重要意义。

目前，葛根种质资源的遗传多样性分析大多采用田间形态指标，如叶形、叶长、叶宽、叶花纹、叶面皱纹、叶柄色、叶柄粗、节间长、茎长、茎粗、分枝数、茎皮色、块根形状等进行鉴定评价[6-8]，但其易受到环境、主观判断等因素的影响，导致鉴定评价结果并不准确，而分子标记鉴定具有快速、准确等优点。近年来，随机扩增多态性(random amplified polymorphic，RAPD)标记[9-11]、内部简单重复序列(inter-simple sequence repeat，ISSR)标记[12-13]、相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)标记[14]等技术已应用于葛根遗传多样性方面的研究，但目前尚未有针对广西地方品种的相关报道。

目标起始密码子多态性标记(start condon targeted polymorphism，SCoT)是首先在水稻上提出的，是以植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性设计单引物并对基因组进行扩增，扩增产物用简单的琼脂糖分离检测的目标分子标记新技术[15]。SCoT分子标记具有操作简单、通用性强、成本低廉、多态性丰富等优点[16]，目前已广泛应用在桃儿七[17]、葡萄[18]、芒果[19]、土豆[20]、枸杞[21]、龙眼[22]、菠萝[23]、兰[24]、柑橘[25]、柳枝稷[26]、铁皮石斛[27]、菊花[28-29]、南瓜[30]、木薯[31]等多种作物的遗传多样性分析、差异表达基因筛选[32-34]等分子生物学研究中，但在葛根遗传多样性分析上尚无相关研究报道。本研究收集了分布于广西各地的葛根共44份种质资源，应用SCoT分子标记技术对其进行遗传多样性及亲缘关系的分析，以期为广西葛根种质资源的鉴定评价、利用及进一步加快广西葛根品种改良及选育提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用的试验材料共计44份葛根种质资源(详见表1)，收集自广西河池、百色、桂林、贺州、玉林、梧州、来宾、南宁、防城港和柳州等地，包括5个栽培品种和39个野生品种，种植于广西农业科学院里建科学研究基地及广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所育种基地。SCoT引物参照文献[15]，由上海生工生物工程股份有限公司合成(表2)。植物基因组DNA提取试剂盒、DL M2000、琼脂糖、核酸染料GelRed、ExTaqDNA聚合酶、50×TAE buffer等均购自宝生物工程(大连)有限公司。

表 1 供试葛根材料及来源Table 1 Tested Pueraria materials and their origins

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取与检测 于2017年5月采集每份葛根种质资源的3～5个无病虫害单株生长顶端的幼嫩叶片，置于写好编号的自封袋后放置于冰盒，带回广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，-40℃保存备用。混合叶片并用液氮研磨成粉末后，按照植物基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa，日本)说明书提取各材料的基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度及完整性，并用UV-2700紫外分光光度计(日本岛津)检测其浓度，稀释成终浓度为50 ng·μL-1，-40℃保存备用。

1.2.2 引物筛选 从供试材料中选取4份形态学差异较大的样品DNA，对36条SCoT引物进行筛选，最终确定稳定性、多态性好且带型清晰的25条引物用于所DNA扩增。

1.2.3 SCoT-PCR扩增与检测 葛根SCoT-PCR扩增体系为20 μL，包括DNA 50 ng，dNTPs 0.25 mmol·L-1，Mg2+1.5 mmol·L-1，引物0.8 μmol·L-1，TaqDNA聚合酶0.5 U，ddH2O补足至20 μL。扩增程序：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸90 s，35个循环；72℃终延伸5 min，4℃保存。反应结束后，取6 μL PCR产物，与1 μL 6×Loading buffer混匀后用含有GelRed核酸染色剂的1%琼脂糖凝胶进行电泳分离，缓冲液为1×TAE，在110 Ⅴ恒电压下电泳约25 min。电泳结束后利用紫外凝胶成像系统拍照保存。

1.2.4 数据统计与分析 根据44份葛根种质资源SCoT-PCR扩增产物的电泳图，按同一分子量大小的DNA条带的有无进行数据统计，有条带记为“1”，无条带记为“0”，构建44份材料的分子标记结果的数据矩阵。利用NTSYS-pc2.10e软件计算遗传相似系数，并进行聚类分析，构建树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 SCoT标记的多态性分析

利用25条SCoT引物对44份葛根种质资源的DNA进行PCR扩增，产物分布在200～3 000 bp之间，共扩增出223条清晰的条带，每条引物扩增出的条带数在3～15之间，平均每条引物能扩增出8.92条。多态性条带合计194条，平均每条引物扩增出7.76条差异性条带，多态性比率高达86.99%。其中，SC2、SC4、SC5、SC12、SC13和SC21这6条引物扩增出的多态性条带比率达到100%，引物SC35扩增产物的多态性比率最低，为50%(表2)。扩增结果表明，利用SCoT标记对葛根种质资源进行扩增，产物表现出条带丰富、背景清晰干净、重复性好且多态性高的特点(图1)。

表2 25条SCoT引物的扩增结果及多态性信息Table 2 Amplification results and polymorphism information of 25 SCoT primes

注：1～44编号同表1。下同。Note: 1-44 are the same as table 1. The same as following.图1 引物SC22的SCoT-PCR扩增结果Fig.1 SCoT-PCR amplification by primer SC22

2.2 相似性分析

将25个引物对44份葛根材料扩增的条带对应的原始数据矩阵导入NTSYS-pc2.10e软件中，计算出各材料之间的遗传相似系数，所有葛根供试材料之间的遗传相似系数范围在0.587～0.982之间。25号与26号材料的相似系数最高，为0.982，二者与24号材料的相似系数均为0.973，三者均为来自广西百色老山的材料；其次为28号与29号材料，二者的相似系数高达0.973，二者与27号材料的相似系数均为0.946，三者均为来自桂林会仙的材料，同时，27号材料与来自桂林平乐的30号材料相似系数高达0.955；来自广西百色田林的7号与8号材料，相似系数为0.951；来自梧州藤县的10号材料与来自桂林阳朔的11号材料，相似系数为0.946。14号与37号材料的遗传相似系数最低，仅为0.587，表明二者亲缘关系最远；37号与4号材料的遗传相似系数为0.601；37号与12号材料的遗传相似系数为0.605。

2.3 聚类分析

由图2可知，在遗传相似系数为0.65水平时，可将44份葛根材料分为两大类，第一类只包含一个材料，即37号材料，其他43份材料归为一类。在遗传相似系数为0.74水平时，可将第二大类的43份葛根材料分为5个亚组，其中，第Ⅰ亚组包含了32份材料，占所有种质资源的72.7%；第Ⅱ亚组包含2号、4号、20号、6号和9号共5份材料；第Ⅲ亚组包含35号、36号和39号共3份材料；第Ⅳ亚组包括21号和22号共2份材料；第Ⅴ组只有14号1份材料。综上，通过SCoT标记技术可以将44份广西葛根种质资源完全区分。

3 讨论

种质资源是进行品种选育的材料基础，遗传多样性的高低决定了物种的基因丰富程度。分子标记技术能快速、准确地对种质资源遗传多样性进行分析[21]。SCoT分子标记技术为通用型引物，适用于各种作物，如多态性条带比率在葡萄中高达93.1%[18]，在菊科作物中高达90.43%[27]，在柳枝稷中达到90.3%[26]，多态性条带比率在柑橘中最低，为54.8%[25]。周精华等[11]利用RAPD技术对来自湖南和江西的8份葛根种质资源进行亲缘关系分析，平均多态性比率为65.65%；景戌等[9]利用RAPD标记对12份重庆地区的葛根进行了遗传多样性分析，平均多态性比率为64.41%；郭艳艳等[12]利用ISSR标记对来自广西、云南、江西和湖北4个地区的11份葛根种质资源进行了多态性及聚类分析，平均多态性比率为63.9%；陈大霞等[14]利用SRAP标记对18个粉葛栽培种进行遗传多样性分析，平均多态性比率为63.9%。本研究采用25条SCoT引物对44份广西葛根种质资源进行遗传多样性分析，检测出了丰富的差异条带，平均多态性比率高达86.99%。本研究采用SCoT技术所获得的多态性比率高于利用RAPD、ISSR和SRAP分子标记技术进行检测的结果，说明SCoT标记对葛根种质资源具有较高的鉴别能力，可进一步应用于葛根遗传多样性分析、分子标记辅助育种等研究。

图2 44份葛根材料的SCoT分子聚类图Fig.2 Dendrogram of 44 Pueraria accessions by SCoT molecular markers

本研究中44份供试葛根材料来自广西不同区域，SCoT聚类结果表明，葛根种质资源的亲缘关系与其来源地具有一定的相关性，但并不完全相关。如来自河池的1号与3号材料，来自百色田林的7号与8号材料，来自百色老山的24号、25号和26号材料，来自桂林会仙的27号、28号、29号和30号材料，分别聚类在一起。但来自同一地域的材料，如来自河池的1号、36号和37号材料，来自桂林的4号和16号材料，均未聚类在一起，而来自不同地域的材料，如梧州藤县的10号材料和桂林阳朔的11号材料相似度较高，反而聚类在一起，表明广西葛根材料具有一定的丰富度，但不同地域的葛根材料可能存在相互引进及交流的现象。这与前人研究结果[12，14]一致。本研究中，5份栽培葛根材料(10号、13号、18号、38号和40号)全部聚类到第一大类的第Ⅰ亚组，其遗传相似系数介于0.74～0.89之间，可能是由于长期驯化和定向选择导致其遗传背景较为接近。同时还发现栽培葛根与野生葛根资源聚类相互交叉，这与袁灿等[13]的研究结果一致。其中，栽培种10号、13号、18号和40号材料分别与野生种11号、12号、27号和41号材料的遗传相似系数均达到0.90以上，其原因可能是因为栽培葛根是从这些野生葛根资源的优良材料中选育而成。37号材料单独聚到一类，与其他种质资源均有较大的遗传差异，田间表型鉴定发现该种质资源的叶片为墨绿色，且完全无毛，与其他种质资源的差异性较大，可进一步通过表型鉴定挖掘其在其他方面的特性，开发与葛根相关性状关联的分子标记等。此外，广西葛根种质间遗传相似度较高，大部分均达到0.72以上，说明其遗传基础较为狭窄，需要进一步加大种质资源引种力度，广泛引进区内外葛根种质资源及创制新种质，丰富种质资源的多样性，为培育优良葛根品种奠定基础。

4 结论

本研究利用25条SCoT引物对44份广西葛根材料的基因组DNA进行PCR扩增，平均每条引物获得7.76个多态性条带，多态性比例为86.99%。聚类分析结果表明，44份葛根种质资源的遗传相似系数介于0.587～0.982之间。在系数为0.65处，44份葛根分为两大类，37号材料单独成为一类；在系数为0.74处，可聚为六类，表明SCoT分子标记适用于葛根种质资源遗传多样性分析。本研究结果为广西葛根种质资源鉴定评价和新品种选育奠定了一定的理论基础。