河南省精神疾病患者弓形虫感染情况调查与分析

张露文，姚志军，王 帅，张振超，王 东，张海珠，刘世国

(新乡医学院寄生虫学教研室，河南 新乡 453003)

刚地弓形虫简称弓形虫，是一种呈世界性分布的专性细胞内寄生原虫，在全世界的血清学调查中阳性率为10%～70%，其中欧洲一些国家的阳性率可高达80%[1]。我国弓形虫的平均感染率为4%～9%[2-3]。宿主免疫力正常者感染弓形虫常无明显临床表现，处于隐形感染状态[4]，但虫体可亲嗜宿主的中枢神经系统，严重时对宿主中枢神经系统产生无法逆转的影响[5-8]。血清学流行病学调查发现，精神分裂症、抑郁症和帕金森症等脑神经系统疾病患者的弓形虫感染率高于正常人群[9]。1958年BUENTELLO等[10]首次提出弓形虫慢性感染可能与精神分裂症有关联，且这一学说近年来得到了许多研究者的支持。STIBBS等[11]研究发现，慢性弓形虫感染的小鼠脑内的多巴胺水平较对照组小鼠高14%，这可能是弓形虫感染引起啮齿类动物和人行为或运动异常的神经生物化学机制。TORREY等[12]研究认为，慢性弓形虫感染的精神分裂症患者有明显的认知功能损伤。国内有学者认为，感染弓形虫的精神分裂症患者病情重于未感染者[13-14]。

目前，国内研究多集中于外周血IgG 抗体的检测，少有弓形虫分子探针检测的报道，基于此，本研究采集同时期住院的精神疾病和非精神疾病患者外周血标本，分别检测血清中IgG 抗体和外周血细胞中弓形虫529分子片段，分别从既往感染、现症感染和持续慢性感染及529核酸定性和定量检测几个方面探讨弓形虫感染与精神疾病的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料采集2013年5月至2014年12月新乡医学院第二附属医院收治的156例精神疾病患者的血液样本(病例组)和新乡医学院第三附属医院各门诊确诊非精神疾病患者血液样品150例(对照组)。病例组患者均符合《中国精神疾病分类方案和诊断标准第3版》中精神病的诊断标准，排除了其他感染性疾病。对照组患者经体检既往无精神病史，无脑器质性疾病。病例组：男136 例，女20 例；年龄10～63(27.6±9.8)岁；疾病类型：精神分裂症116例，其他(包括双相情感障碍、抑郁症、强迫症、躁狂症等)40例；居住地：城市86例，乡村70例。对照组：男75例，女75例；年龄5～85(38.9±11.5)岁；居住地：城市69例，乡村81。参照文献[16-17]分组方法，将病例组患者分为10～19岁组、20～29岁组、30～39岁组、40～49岁组和>50岁组。

1.2 试剂与仪器弓形虫IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)购自珠海经济特区海泰生物制药有限公司；2×Taq MasterMix (Dye)、DM1000 Marker、2×UltraSYBR Mixture (High ROX)购自北京康为世纪生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯；所用引物序列参考文献[15]，引物由上海生工生物工程有限公司合成。MK3酶标仪购自德国Thermo公司，Master cycler 梯度PCR仪购自德国Eppendorf公司，Nanodrop2000紫外分光光度计购自德国Thermo公司，实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪购自美国ABI公司，EC3-Darkroom510 Imaging System凝胶成像仪购自美国UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 调查2组患者均进行临床问诊，记录性别、年龄。

1.3.2 弓形虫特异性IgG抗体检测2组患者于临床问诊后次日8：00抽取空腹肘静脉血5 mL，室温静止1.5～2.0 h,2 500 r·min-1离心 15 min，吸取血清于新的无菌离心管中，置于 -20 ℃ 下贮存。使用弓形虫IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)检测2组患者血清中IgG抗体含量，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。用酶标仪读取样本在450 nm和630 nm处的吸光度(A)值，以A450-A610计算ΔA值。判断标准：阳性对照ΔA平均值≥0.50，阴性对照ΔA平均值≤0.10，临界对照ΔA平均值介于0.12～0.35，证明实验有效。以样品ΔA值≥临界对照ΔA平均值为IgG抗体阳性，样品ΔA值< 临界对照ΔA平均值为IgG抗体阴性。弓形虫IgG抗体阳性者代表患者既往感染弓形虫。

1.3.3 弓形虫529序列PCR检测采用酚试剂法提取病例组和对照组患者血细胞DNA，紫外分光光度计测定核酸浓度及其A值，DNA浓度均不低于 50 mg·L-1，A值为1.6～1.9。DNA放置于-20 ℃下贮存。以血细胞DNA为模板，以弓形虫RH株滋养体(新乡医学院寄生虫教研室传代保种)DNA为阳性对照，双蒸水(distillation-distillation H2O，ddH2O)为空白对照进行巢式PCR检测。反应体系为25 μL：2×Taq Master Mix (Dye)12.5 μL，DNA模板2 μL，0.5 μmol·L-1外部上游引物和外部下游引物各2.5 μL，5 μmol·L-1内侧上游引物和内侧下游引物各2.5 μL，ddH2O补足至25 μL。反应条件：95 ℃变性 2 min，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸 50 s，15个循环；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环。取10 μL扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像系统分析电泳结果。巢式PCR阳性者代表患者在样品采集期现症感染弓形虫。IgG抗体阳性及巢式PCR均阳性者代表患者持续慢性感染弓形虫。

1.3.4 弓形虫虫体拷贝数检测以弓形虫拷贝数为2.73×101、2.73×102、2.73×103、2.73×104、2.73×105、2.73×106、2.73×107、2.73×108的弓形虫RH株滋养体DNA模板做阳性对照标准曲线，将对照组和病例组患者血细胞DNA进行荧光定量PCR检测其弓形虫虫体拷贝数。反应体系为 25 μL：2×UltraSYBR Mixture (High ROX) 12.5 μL，DNA模板2 μL，10 μmol·L-1上游引物、下游引物各0.5 μL，ddH2O补足至25 μL。反应条件：95 ℃变性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃ 7 min。使用ddH2O作为空白对照。

2 结果

2.1 弓形虫特异性IgG抗体检测及529序列定性检测结果见图1。对照组患者中弓形虫特异性IgG抗体阳性3例(2.0%)，巢式PCR阳性0例(0.0%)，IgG抗体阳性及巢式PCR均阳性者3例(2.0%)，总阳性例数6例(4.0%)。病例组患者中弓形虫特异性IgG抗体阳性82例(52.6%)，巢式PCR阳性16例(10.3%)，IgG抗体阳性及巢式PCR均阳性者8例(5.1%)，总阳性例数106例(67.9%)。对照组患者的既往感染率、现症感染率及持续慢性感染率比较差异均无统计学意义(P>0.05)；病例组患者的既往感染率高于现症感染率和持续慢性感染率，差异有统计学意义(χ2=64.800、85.510,P<0.01)，现症感染率与持续慢性感染率比较差异无统计学意义(χ2=4.500，P>0.05)。病例组患者弓形虫感染总阳性率显著高于对照组，差异有统计学意义(χ2=148.040，P<0.01)。

M：Marker；1:阳性对照；2：阴性对照；3～7：对照组血细胞DNA样品；8～12：病例组血细胞DNA样品。

图1 2组患者血细胞中弓形虫529重复序列检测凝胶电泳

Fig.1 Gel electrophoresis diagram of 529 repeat sequence ofToxoplasmagondiiin blood cells in the two groups

2.2 弓形虫虫体拷贝数检测结果病例组和对照组患者血细胞中弓形虫虫体拷贝数分别为(4.057±1.979)×107、(1.089±0.014)×106copies ·L-1;病例组患者血细胞中弓形虫虫体拷贝数高于对照组，差异有统计学意义(t=0.580，P<0.01)。

2.3 精神疾病患者既往感染、现症感染、持续慢性感染弓形虫可能因素分析结果见表1。各年龄段精神疾病患者弓形虫既往感染率、持续慢性感染率及感染总阳性率比较差异均无统计学意义(χ2=0.429、0.286、4.875，P>0.05)；40～49岁组患者现症感染率高于10～19岁、20～29岁、30～39岁及>50岁年龄组患者，差异有统计学意义(χ2=16.340、15.012、15.693、16.035，P<0.05)；10～19岁、20～29岁、30～39岁及>50岁年龄组患者现症感染率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。10～19岁、20～29岁、30～39岁、>50岁组患者既往感染率高于现症感染、持续慢性感染率，差异有统计学意义(P<0.01)；现症感染率与持续慢性感染率比较差异均无统计学意义(χ2=0.680，P>0.05)。40～49岁组患者既往感染率高于持续慢性感染率，差异有统计学意义(χ2=15.312，P<0.05)；现症感染率与既往感染率、持续慢性感染率比较差异均无统计学意义(χ2=0.500、0.500，P>0.05)。

不同性别患者之间的既往感染率、现症感染率、持续慢性感染率及感染总阳性率比较差异均无统计学意义(χ2=1.030、1.241、1.244、0.045，P>0.05)。男性和女性患者的既往感染率均高于现症感染率、持续慢性感染率，差异有统计学意义(χ2=85.193、21.538，P<0.01)；现症感染率与持续慢性感染率之间比较差异均无统计学意义(χ2=0.000，P>0.05)。

精神分裂症患者和其他精神疾病患者之间的既往感染率、现症感染率、持续慢性感染率及感染总阳性率比较差异均无统计学意义(χ2=6.600、2.915、2.915、1.236，P>0.05)。精神分裂症患者和其他精神疾病患者的既往感染率均高于现症感染率、持续慢性感染率，差异有统计学意义(χ2=56.250、56.257、48.001、48.000，P<0.01)；现症感染率与持续慢性感染率比较差异均无统计学意义(χ2=0.000，P>0.05)。

表1 不同年龄、性别和疾病类型精神疾病患者的弓形虫感染情况比较

Tab.1 Comparison ofToxoplasmagondiiinfection among different age,sex and disease type psychiatric patients

因素n既往感染/例(%)现症感染/例(%) 持续慢性感染/例(%)总阳性/例(%)年龄 10～19岁4226(61.9)2(4.8)ab2(4.8)b30(71.4) 20～29岁5432(59.3)2(3.7)ab0(0.0)b34(62.9) 30～39岁3618(50.0)0(0.0)ab4(11.1)b22(61.1) 40～49岁126(50.0)4(33.3)0(0.0)b10(83.3) >50岁108(80.0)0(0.0)ab2(20.0)b10(100.0)性别 男13679(55.9)8(5.9)b8(5.9)b92(67.6) 女2014(70.0)0(0.0)b0(0.0)b14(70.0)疾病类型 精神分裂症11660(51.7)8(6.9)b8(6.9)b76(65.5) 其他精神疾病4030(75.0)0(0.0)b0(0.0)b30(75.0)

注：与40～49岁组比较aP<0.05；与既往感染率比较bP<0.05。

3 讨论

目前诊断弓形虫感染的方法主要是采用酶联免疫吸附试验检测患者血清样本中的特异性IgG和IgM抗体是否呈阳性，或者采用巢式PCR定性检测样品中特定弓形虫基因序列。本研究检测了河南省精神疾病患者与非精神疾病患者弓形虫在既往感染、现症感染及持续慢性感染的情况。结果显示，精神疾病患者IgG抗体阳性率明显高于非精神疾病患者，与国内外多家报道一致[18]。精神疾病患者弓形虫感染总阳性率是非精神疾病患者的16.975倍，高于国内外其他报道[19-22]。孙慎侠等[23]通过酶联免疫吸附试验检测94例精神病患者的弓形虫IgG抗体阳性率为25.53%，对照组为10.34%。本研究结果显示，不同年龄、性别及精神疾病类型患者的弓形虫感染总阳性率比较差异均无统计学意义，与国内外报道一致[16-17，25]。同时，随着年龄增加，精神疾病患者弓形虫感染总阳性率整体呈增高趋势。推测原因为弓形虫是一种机会性致病原虫，而患者在生活过程中随时间延长增加了感染弓形虫的概率。不同年龄、性别和精神疾病类型患者的弓形虫既往感染率均高于现症感染率和持续慢性感染率。10～19岁、20～29岁、30～39岁和>50岁精神疾病患者中，弓形虫的既往感染率均显著高于同组内现症感染率及持续慢性感染率，而现症感染率与持续慢性感染率比较差异均无统计学意义；40～49岁精神疾病患者中只有既往感染率高于持续慢性感染率。男性精神疾病患者的弓形虫既往感染率低于女性，现症感染和长期慢性感染均高于女性，但差异均无统计学意义。这可能是由于女性在承担家务劳动过程中，增加了接触生肉的机会，因此增加了机会性感染弓形虫的概率。弓形虫在精神分裂症患者中的既往感染率高于现症感染率，提示了精神分裂症患者弓形虫感染多为慢性期，与精神分裂症的慢性病程一致。有研究显示，弓形虫感染在精神分裂症的发生、发展中起重要病因作用[9]。也有研究发现，治疗精神分裂症及其他精神疾病的药物对弓形虫的增殖有明显抑制作用，如氟哌啶醇和丙戊酸[26]。

弓形虫几乎可以在所有有核细胞内寄生，全世界成年人中至少有1/3的人感染弓形虫[27]，欧洲一些发达国家感染率高达80%,我国血清学调查显示弓形虫抗体阳性率为5%～20%[28]。有研究证明，弓形虫具有嗜神经细胞的特点，可通过血脑屏障进入中枢神经系统，特别是在大脑中的弓形虫从速殖子向缓殖子转换时会引发一系列的免疫反应，从而对宿主大脑造成不可逆性损伤，因此，弓形虫感染可能是精神疾病的重要诱因之一[29]。GARRUTHERS等[29]研究指出，寄生虫和宿主之间特殊的结合能够影响精神障碍和大脑生理功能。但是将弓形虫感染作为精神疾病患者的确切病因仍存在一定的问题，如有些地区的弓形虫感染率很高，但是精神疾病患者人数却并不多；同时，并不是所有的精神疾病患者均可检测出弓形虫抗体。免疫力正常的患者感染弓形虫后一般不表现出特异性临床症状，因此，弓形虫感染未得到相关卫生工作者的足够重视。但近些年越来越多的研究证明了感染弓形虫对机体的危害，因此，相关临床医生应重视对精神疾病患者的弓形虫检测，防止弓形虫感染给患者带来的严重后果。同时应注意对已经感染弓形虫的人群进行精神疾病的预防和自查。