GB/T 8312—2013高效液相色谱法与紫外分光光度法检测固态速溶茶中咖啡碱含量的比较

胡银凤，吴小婷，陈秋香，朱宏斌，王淑凤*

1.大闽食品（漳州）有限公司，363000；2.长泰县质量计量检验检测所，363900

咖啡碱又名咖啡因，是固态速溶茶中含有的生物碱之一，属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤，它与可可碱和茶叶碱通过次黄嘌呤核苷酸的转变而成，并在嘌呤代谢中互相转化。咖啡碱的基本结构是嘌呤环，它是由嘧啶和咪唑缩合而成的杂环体系。咖啡碱是具有绢状光泽的针状晶体，无水咖啡碱为白色粉末，熔点235～238°C，在120°C下升华，能溶于乙醇、丙酮，易溶于氯仿，较难溶于乙醚和苯。咖啡碱的水溶液呈中性，能与酸生成盐，咖啡碱能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋，无臭，具有苦味，是茶叶重要的滋味物质之一，占固态速溶茶总量的2%～12%不等，与儿茶素、茶黄素等形成的络合物具有鲜爽味[1-4]。

当前，各种固态速溶茶饮料已经成为饮食中摄取咖啡碱频率较高的一个重要来源[5]。因此，采用简便、快速、可靠、分析成本低的分析方法来

对固态速溶茶饮料中咖啡碱含量进行检测非常重要。咖啡碱传统的分析方法有碘量法[6]、薄层色谱法[7-8]、近红外光谱法[9-11]、气相色谱法[12-13]、紫外分光光度法[14-16]和高效液相色谱法[17-21]等。《茶咖啡碱测定》（GB/T 8312—2013）中规定茶叶及固态速溶茶中咖啡碱的检测可采用高效液相色谱法（HPLC）或紫外分光光度法（UV）。本文对这两种方法检测的差异进行探讨，并尝试计算这两种方法的检测结果间的转换系数[22]。

一、材料与方法

1.仪器与设备

Waters 2487高效液相色谱仪（美国沃特世公司），TU 1900双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用公司），AR1140型电子分析天平（0.0001 g，美国奥豪斯公司），明澈-D 24UV纯水/超纯水系统（美国密理博公司），SHA-B水浴恒温振荡器（金坛市新航仪器厂），Phenomenex Luna C18色谱柱（美国菲罗门公司）。

2.试剂及标准液

甲醇（色谱纯，上海安谱CNW），盐酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），氧化镁（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），碱式乙酸铅（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），咖啡碱标准品（99%，美国阿法埃莎公司）。

3.样品前处理

（1）高效液相色谱法

准确称取0.1 g左右（精确至0.0001 g）速溶茶样品，置于100 mL具塞三角烧瓶中，加入0.9 g左右氧化镁及60 mL沸水，放于水浴恒温振荡器中加热振荡提取20 min，提取完毕后立即趁热减压过滤，滤液移入100 mL容量瓶中，待冷却后，用水定容至刻度，混匀后过0.45 μm滤膜，待测。

（2）紫外分光光度法

准确称取0.2 g左右速溶茶样品，用80°C水溶解，冷却后定容至100 mL，作为提取液。准确移取10 mL提取液于100 mL容量瓶中，加入4 mL盐酸溶液，1 mL碱式乙酸铅溶液，用水稀释并定容至刻度，摇匀并静置澄清后过滤。再移取滤液25 mL，置于50 mL容量瓶中，加入0.1 mL硫酸溶液，用水稀释至刻度，摇匀。静置澄清后过滤待测。

4.仪器条件

（1）高效液相色谱条件

检测波长：280 nm，流动相：甲醇-水溶液（30∶70，V/V），流速：1 mL/min，柱温箱温度：40°C，进样量：10 μL。

（2）紫外分光光度计条件

紫外波长：274 nm，比色皿：10 mm石英比色皿。

5.检测方法

（1）标准曲线及样液浓度检测

①高效液相色谱法

准确称取一定量的咖啡碱标准品，用乙醇-水溶液（1∶4，V/V）溶解后制备成500 μg/mL标准储备液，再用水逐级稀释至10、20、50、100 μg/mL的系列标准工作液。上机检测得到咖啡碱不同浓度的峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，测得线性回归方程。依据高效液相色谱法的样品前处理步骤处理样品，检测样液，根据回归方程，可得样液浓度，然后计算结果。

②紫外分光光度法

准确称取一定量的咖啡碱标准品，用水将其稀释成1 mg/mL的标准储备液，再用水将其稀释成50 μg/mL的标准工作液。分别吸取0、1、2、3、4、5 mL标准工作液于25 mL容量瓶中，分别各加入1 mL盐酸溶液，用水稀释至刻度，即浓度分别为0、2、4、6、8、10 μg/mL的系列标准工作液，以试剂空白溶液为参比，上机检测吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，测得线性回归方程，依据紫外分光光度法的样品前处理步骤处理样品，检测样液，根据回归方程，可得样液浓度，然后计算结果。

（2）方法精密度试验

分别称取速溶红茶、速溶绿茶、速溶乌龙茶3个不同类型的速溶茶样品，每个样品平行称取6份，再分别使用高效液相色谱法和紫外分光光度法检测，分别计算其标准偏差（RSD）。

（3）方法准确度试验

分别称取速溶红茶、速溶绿茶、速溶乌龙茶3个不同类型的速溶茶样品，每个样品平行称取6份，每份样品分别加入咖啡碱标液（10 mg/mL）0.2 mL和0.4 mL，分别使用上述两种不同检测方法检测各固态茶粉中的咖啡碱含量，计算其回收率和标准偏差（RSD）。

二、结果与分析

1.两种方法的精密度比较

采用高效液相色谱法和紫外分光光度法检测不同速溶茶粉中咖啡碱的含量，检测结果及标准偏差（RSD）如表1、表2。结果表明，紫外分光光度法的检测结果明显高于高效液相色谱法，高效液相色谱法检测结果RSD在1.5%～1.7%之间，而紫外分光光度法的RSD在1.1%～3.3%之间。

表1 两种方法检测的咖啡碱含量（n=6）%

表2 两种方法检测咖啡碱的标准偏差（n=6） %

两种检测方法所得结果有差异的原因，主要是速溶茶中含有的多酚类、糖类及色素类物质会干扰咖啡碱在分光光度计上的特征吸收光谱的吸收值，不同茶类速溶茶中这些物质的含量各异，因此使用紫外分光光度法检测不同茶类速溶茶中的咖啡碱结果相对较不稳定，且往往检测结果稍高于高效液相色谱法。使用高效液相色谱法检测时，咖啡碱物质溶解在流动相中，在色谱柱中与其他组分（如儿茶素、咖啡酸等）因物质极性不同而分离后，再对其含量进行检测，因此，杂质对其干扰相应较小，检测结果的重复性也相对较稳定。

2.两种方法的准确度比较

高效液相色谱法与紫外分光光度法检测速溶茶中的咖啡碱含量及加标回收率结果如表3，加标平均回收率与标准偏差如表4。从表3、表4中可见，高效液相色谱检测不同茶类速溶茶中的咖啡碱加标平均回收率为96.7%～99.7%，标准偏差为1.6%～2.2%；而紫外分光光度法检测的加标平均回收率在86.6%～91.4%之间，标准偏差为5.1%～7.2%。因此，相比于紫外分光光度法，高效液相色谱法更能真实反映速溶茶中咖啡碱的含量。

3.两种方法的操作便捷性比较

高效液相色谱法在检测过程中使用的试剂甲醇、乙醇及氧化镁在危险性及毒性上均低于紫外分光光度法所使用的碱式乙酸铅、盐酸和硫酸等，能够更好地保障实验人员的人身安全。此外，使用高效液相色谱法检测单个样品一般情况下均能够在1 h内完成全部检测过程，而紫外分光光度法检测单个样品需4～5 h。因此，使用高效液相色谱法检测能够大大缩短检测的时间，提高检测效率。

4.两种方法检测结果间的换算

由于高效液相色谱法检测速溶茶中的咖啡碱含量在精密度、准确度、检测效率上均好于紫外分光光度法，且在操作安全性上也优于紫外分光光度法，因此，该方法也是中国及世界各国和地区在检测茶叶及茶粉中咖啡碱的首选方法。但是，由于该方法所需的高效液相色谱仪价格较昂贵，对国内许多小型企业实验室来说投入较大，可能无法满足部分客户使用高效液相色谱法检测咖啡碱含量的需求。因此，本研究进一步探寻以上两种方法检测咖啡碱含量的结果是否具有一定的换算关系。

表3 两种方法检测速溶茶中的咖啡碱含量及加标回收率结果（n=6）

表4 两种方法检测速溶茶中的咖啡碱加标平均回收率与标准偏差（n=6）%

选用速溶红茶、速溶绿茶、速溶乌龙茶各50只样品，分别采用高效液相色谱法和紫外分光光度法检测样品中的咖啡碱含量，检测结果如表5。从表5中数据可见，采用高效液相色谱法和紫外分光光度法检测咖啡碱含量，速溶红茶两者之间的换算系数在0.70～0.85之间，平均换算系数为0.77，50个系数之间的相对标准偏差为4.43%；速溶绿茶的换算系数在0.49～0.68之间，平均换算系数为0.60，相对标准偏差为7.72%；速溶乌龙茶的换算系数在0.74～0.89之间，平均换算系数为0.83，相对标准偏差为3.39%。从数据可见，不同茶类的速溶茶采用高效液相色谱法及紫外分光光度法两种方法检测咖啡碱结果之间的换算系数有较大的差异，但同种速溶茶之间的换算系数差异较小，均在一个比较稳定且合理的区间内，3种速溶茶换算系数的标准偏差均小于10%。因此，我们可以采用它们的平均换算系数，即0.77、0.60和0.83作为高效液相色谱法和紫外分光光度法检测速溶红茶、速溶绿茶及速溶乌龙茶中咖啡碱结果间的换算系数，在一定程度上解决无高效液相色谱法检测条件的困难。

三、结论

通过比较GB/T 8312—2013中的两种方法在检测速溶茶咖啡碱含量之间的差异，发现高效液相色谱法在检测数据的精密度、准确度、检测效率及对实验人员的安全性上比紫外分光光度法均有明显优势。

表5 两种方法检测咖啡碱的结果比较

此外，通过试验得出，采用高效液相色谱法和紫外分光光度法检测速溶红茶、速溶绿茶及速溶乌龙茶咖啡碱含量时，两种方法检测结果之间的换算系数分别为0.77、0.60及0.83，这些换算系数可为需要采用高效液相色谱法检测上述3种速溶茶中的咖啡碱含量而又没有条件的小型实验室提供参考。