猫爪草提取物对猪源大肠杆菌体外抑菌试验研究*

王瑞，姜现垒，董建国，曲哲会，赵瑜，张建录，刘涛**

（1.信阳农林学院牧医工程学院，河南信阳，464000；2.信阳市平桥区畜牧工作站河南信阳464100）

猪源大肠杆菌是造成新生仔猪断奶后仔猪腹泻的最重要病原，由于大肠杆菌血清型众多，且抗生素耐药性问题日益突出，寻找具有抑制大肠杆菌的中药品种具有十分重要的意义。猫爪草原为无名野草，药用历史较短，是上世纪50 年代于河南省信阳地区发现的一种草药，后经信阳中医院依据其根形及能治疗鼠疮的特点定名为“猫爪草”[1]。本文通过纸片法、打洞法、牛津杯法、试管二倍稀释法，探讨猫爪草提取物对猪源大肠杆菌体外抑菌效果。

1 材料

1.1 药物及试剂

猫爪草购自信阳市淮滨县中草药市场；营养琼脂培养基、肉汤培养基购自杭州滨河微生物试剂有限公司；猪源大肠杆菌由河南省信阳农林学院牧医工程学院动物疾病监测实验室提供。

1.2 中药药液的提取

将50g 猫爪草放入500mL 水中，浸泡30min 以后再煮沸30min。冷却后用智能真空泵及布氏漏斗对药液进行过滤，滤液备用。于沉渣中加500mL 水，第二次煮沸30min。冷却后用智能真空泵及布氏漏斗对药液进行过滤。然后将两次滤液倒在一起，离心除去沉淀的沉渣，将滤液放至水浴锅进行浓缩至50mL。此时制得的药液浓度为1g/mL。

1.3 药敏片的制备

取定性滤纸，制作成6mm 直径的圆形纸片，将纸片进行高压灭菌烘干备用。将药液制备成1g/mL、0.75g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL 的浓度，各取1mL 药液分别浸泡50 片药敏试纸片1h，将浸泡好的药敏片烘干。4℃保存备用。

1.4 菌液的制备

取甘油冷冻保存的大肠杆菌冻存管，放置到40℃恒温水浴锅中复苏。抽取菌液注入至肉汤培养基中，37℃培养18～24h。保存备用。

2 方法

2.1 细菌平板计数

将大肠杆菌肉汤培养物用涂菌棒涂布到营养琼脂培养基表面，37℃培育16 h 后，挑取单个菌落再次接种到肉汤培养基中，培养后计数，将肉汤稀释至105CFU/mL，置4℃冰箱内保存。

2.2 分光光度计计数

将菌液加入含有5mL 营养肉汤的试管中，放入37℃恒温振荡箱，分别于2h、3h、4h、5h、6h、7h 每隔一小时取2mL 培养液经分光光度计测量600nm 细菌的OD 值，用蒸馏水做对照，绘制细菌生长曲线，并观察细菌生长达到峰值的时间。

2.3 体外抑菌实验

2.3.1 药敏片法

抽取100μL 菌液注入到营养琼脂培养基上，并用涂菌棒涂布均匀。将药敏片均匀贴到培养基表面。待干燥后，贴上不同浓度的（1g/mL、0.75g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、对照组）的药敏片。将培养基置37℃恒温培养箱中18h，量取抑菌圈直径。

2.3.2 打孔法

抽取100μL 菌液注入到培养基上并涂布均匀。静置干燥5min，用打孔器等距打五个孔，在孔内注入不同浓度的药液（1g/mL、0.75g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、对照组）50μL。将培养基置于37℃温箱中培养18h 后，量取抑菌圈直径。

2.3.3 牛津杯法

用灭菌棉签将稀释好的浓度为105CFU/mL 的菌液均匀地涂抹于营养琼脂表面。将五个灭菌的牛津杯，等距放置在培养基上，牛津杯孔内加入不同浓度的药液（1g/mL、0.75g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、对照组）50μL。将营养琼脂基置于37℃温箱中培养18h，分别量取抑菌圈直径。

2.3.4 最小抑菌浓度测定

准备10 支试管，在第1 支试管注入1.5mL 药液和0.5mL 肉汤，调整药液浓度为0.75g/mL；其余9 支试管依次注入2mL 营养肉汤，在第2 支试管注入2mL 浓度为1g/mL 药液，多次混合均匀，再吸取2mL 注入第3 只试管，依次稀释到第9 只试管，最后弃去2mL；最后再往每一支试管中注入100μL 菌液。同时设置对照组，将试管标记好放置于37℃恒温箱培育过夜，观察结果。

3 结果与分析

3.1 抑菌圈

见表1：结果判定标准：参考引文[1]。实验表明，三种不同方法结果均表明猫爪草提取液在0.75g/mL 和1g/mL 浓度时，对大肠杆菌表现出抑菌效果。

表 1 不同方法测定的平均抑菌圈大小

图2 药敏片法

图3 打孔法

图4 牛津杯法

3.2 最低抑菌浓度

见表2：判定标准参考引文[1]。

见图5 和图6，标记为D-J 试管均有明显浑浊，取A、B、C 清亮的的混合液，涂布平板，涂A 试管的平板仅长出个别菌落，B、C 平板长满菌落，判定0.75g/mL 是最小抑菌浓度，将该平板培育48h，出现大量菌苔。

表 2 二倍稀释法试管浓度

图5 不同浓度药液与菌液混合培养物

图6 不同浓度混合培养物涂布培养基

3.3 最低杀菌浓度

见表3，判定标准参考引文[1]。

见图6，原药液浓度浓缩为2g/mL 后，重复上述操作，后6 支试管均有明显浑浊，取a、b、c、d 清亮的混合液，涂布营养琼脂培养基。涂a 试管混合液的营养琼脂培养基仅生长出个别菌落，b、c、d 平板长满菌苔，继续培养48 h，涂布a 试管混合液的营养琼脂平板上仍仅有个别菌落，判定1g/mL 为MBC。

表 3 二倍稀释法试管浓

4 讨论与结论

4.1 讨论

本试验为水煎法制得中药提取物，和引文标注的醇提法不同[1]。一般醇提法可降低杂质部分含量。提取方法与中药的抑菌效果有一定联系。需要进一步试验醇提法制备猫爪草提取物，验证其抑制猪源大肠杆菌的效果。目前中药体外抑菌试验主要有纸片扩散法和二倍稀释法，但是试验过程可能会受到细菌耐药性、中药有效部位的提取方法影响。因此本试验采用药敏片法、打孔法和牛津杯法三种方法分别测量抑菌圈大小，试验对象统一，尽可能保证试验结果的稳定性。临床上猪源大肠杆菌分离株较多，此次试验仅对1 株猪源大肠杆菌进行了体外抑菌试验，今后还需陆续对更多的分离株进行相关试验。

4.2 结论

采用水提法获得的猫爪草提取物对分离的猪源大肠杆菌具有一定的抑菌效果。通过试验结果可知，猫爪草提取物对该株大肠杆菌的最低抑菌浓度是0.75g/mL，最低杀菌浓度是1g/mL。猫爪草过去主要用于治疗肺结核、淋巴结炎、咽喉炎、疖病、肿瘤等疾病。通过此次试验，证实其对猪源大肠杆菌同样具有抑菌效果，在减抗替抗的养殖业大背景下，猫爪草具有一定的开发利用

图7 最小杀菌浓度的测定