一例引进鸭感染鸭瘟病毒的PCR检测诊断

2 饶体宇李 婷 张 益 包细明 吴伯梅 彭庆波

(1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2.贵州省动物疫病研究所，贵州 贵阳 550025)

鸭瘟又称鸭病毒性肠炎，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)的鸭瘟病毒(Duck plague virus， DPV)引起鸭、鹅和其他雁形目水禽的急性、热性、败血性传染病[1]。DPV有极强的传染力，传播速度快，发病率和死亡率高，给养鸭业造成很大的经济损失。主要造成血管的破坏，内脏器官和淋巴器官的广泛出血[2]。潜伏期为2～7天，出现症状后常在1～5天内死亡，病情缓慢的可延长至1周以上，通常感染后陆续死亡[3]。2019年3月，贵阳市某蛋鸭养殖场引进鸭7 天后发生疫情，现将诊断情况介绍如下。

1 流行病学调查

2019年3月19日该场新引进90日龄鸭 5 000羽，7天后突然发病，陆续死亡，共计死亡3 142羽，死亡率达62.84%(3 142/5 000)。引进鸭曾接种禽流感、新城疫重组二联活疫苗，发病后使用抗生素、抗应激药物治疗无效。

2 临床症状

患病鸭初期眼部有浆液性分泌物，致使眼部周围羽毛粘连，无法睁眼；眼睑水肿，眼结膜充血；精神萎靡，呼吸困难，食欲减退至废绝。

3 病理变化

将养殖场送检的4只病死鸭进行剖检，可见颈部皮下出血，食道有溃疡灶，气管出现环状出血，肠浆膜表面有出血点，肌胃表面有出血斑和出血点，腺胃壁出血，肝脏有出血点，心肌内膜充血，泄殖腔黏膜充血水肿。根据典型病理变化初步诊断为鸭瘟。

4 实验室PCR检测

为确定病原，无菌采集4只病死鸭的心、肾、肺、肝、脾组织病料，剪碎研磨并匀浆，反复冻融4次，8 000 r/min 离心5 min，取上清液用DNA柱式提取试剂盒提取病原核酸。根据参考文献[5]合成特异性引物：DPV-UL6-F：5’-GAAGCATATCGTTCGGAGG AG-3’，R：5’-TATCGCCTGCCAACTTATATCG-3’(登录号：AY995224)。引物由英潍捷基(上海)贸易公司合成，预扩增片段大小376 bp。PCR扩增采用25 μL反应体系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板 2 μL，最后加ddH2O补足25 μL。反应程序：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 45 s，56 ℃退火 45 s，72 ℃延伸45 s，扩增35个循环；72 ℃终延伸 10 min，4 ℃反应结束。同时设立DPV阳性对照与阴性对照。凝胶成像系统观察结果(见图1)：4份病料提取的DNA样本经过PCR扩增有3份病料扩增出约376 bp的特异性条带，与预扩增大小基本相同，确定为DPV感染。

图1 病原核酸PCR检测结果M：DL 2 000 DNA Marker； 1～4：检测病料；5：阴性对照(ddH2O)； 6：阳性对照

5 小结

5.1通过对病鸭的流行病学调查、临床症状、病理变化等进行初步诊断，发现其病变(食道出现溃疡灶、肠浆膜出血、气管环状出血)与鸭瘟的病变极其相似。进一步设计鸭瘟病毒特异性引物，进行鸭瘟病毒核酸PCR检测，确诊为鸭瘟病毒感染。

5.2鸭瘟的防控措施：(1)鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗对鸭瘟有良好的免疫效果，雏鸭出生20天后进行第 1次接种，可有效降低鸭瘟病毒的感染。如果已有鸭瘟发生，发病鸭要紧急接种鸭瘟活疫苗(10倍剂量)并饲喂添加抗菌药物的饲料(玉米粒24 kg+阿莫西林40 g+氟苯尼考83 g，混匀)防止细菌继发感染加重病情。其他未发病的鸭接种鸭瘟活疫苗(4倍剂量)并饲喂增强免疫力的中成药(玉米粒24 kg+芪黄素80 g+双黄连160 g，混匀)提高鸭的免疫力，控制病情的蔓延[6]。(2)引进鸭时要求出售方提供免疫记录档案，不在无免疫记录档案或者记录档案不清楚的鸭场引种；运载车辆在运输前应进行彻底消毒，路途不经过疫区[7]。(3)引进鸭进场后需要在隔离区隔离观察7天并进行检疫，确定健康后才能混群饲养。(4)养殖人员在进入养殖区前必须进行消毒、换鞋。保持鸭舍通风，定期进行清扫消毒，控制好湿度、温度及饲养密度。饲喂全价饲料，根据鸭群的采食量控制饲喂量，防止饲料霉烂变质。