五味子乙素对AngⅡ诱导心肌纤维化中AkT、mTOR、TGF-β1 表达的影响

滕春晓， 金红花，2∗， 洪 兰

（1.延边大学药学院，吉林 延吉133000；2.延边大学附属医院药学部，吉林 延吉133000；3.延边大学医学院生理学与病理生理学教研部，吉林 延吉133000）

高血压、心肌梗死、心肌炎等疾病均可导致心室重构、心肌细胞凋亡等病理生理改变，进而发展为慢性心力衰竭，心肌纤维化是其病理基础［1］，它是以心肌成纤维细胞过度增殖、胶原蛋白生成增加、细胞外基质过度失衡与沉积为主要表现的疾病［2］。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统在大多数心血管系统疾病中发生活化，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ） 能促进心肌成纤维细胞增殖，胶原生成增多［3］，与心肌纤维化密切相关。五味子乙素是五味子主要药用成分木脂素的成员之一［4］，对心脏有保护作用，但目前尚未明确其作用机制［5］。因此，本实验考察五味子乙素对AngⅡ诱导心肌纤维化中AkT、mTOR、TGF-β1 表达的影响。

1 材料

1.1 动物 出生1～3 天的SD 大鼠乳鼠，由延边大学实验动物中心提供， 动物生产许可证号码 SCXK （吉）2017-0003。

1.2 试药 五味子乙素购自上海源叶生物科技有限公司，批号P29J8F38066；AngⅡ购自玛雅试剂有限公司，批号MAYA-CR-7157；胎牛血清（FBS） 购自美国Gemini 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、磷酸盐缓冲液（PBS） 购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM、双抗（青霉素-链霉素溶液）、0.25%胰蛋白酶-EDTA、Ⅱ型胶原酶购自美国Gibco 公司；转化生长因子-β1（TGF-β1）、Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）、蛋白激酶B（AkT）、雷帕霉素购自英国Abcam 公司；雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR、p-AKT 购自美国Cell Signaling Technology 公司；β-actin 购自北京博奥森生物技术有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购自长春纳川科技发展有限公司；牛血清白蛋白（BSA） 购自美国Sigma 公司。

1.3 仪器 371 CO2细胞培养箱购自赛默飞世尔科技（中国）公司；IX70-112 倒置显微镜购自日本Olympus 公司；EON 酶标仪购自美国BioTek 公司；WE-180B 垂直电泳仪、VE-186 转移电泳仪购自上海天能科技有限公司；Fluor chemuon 凝胶成像仪购自美国Protein Simple 公司。

2 方法

2.1 细胞分离 14 只乳鼠浸入75%乙醇5 min 后取出，在超净工作台中将其胸部向上，小剪刀剪开乳鼠胸腔，充分露出心脏，放入37 ℃预热的PBS 中，剔除大血管等组织，留取心尖部心室组织，PBS 洗涤1 次，剪碎（＜1 mm3）后移到50 mL 离心管中，弃去PBS，加入4 mL 0.1%Ⅱ型胶原酶消化液，于37 ℃水浴消化10 min 后弃上清，剩余沉淀物用Ⅱ型胶原酶消化液摇动消化4 次，每次10 min，收集上层细胞悬液，加入等量培养基终止反应。将消化的细胞悬液收集到50 mL 离心管中，1 200 r／min 离心5 min，弃去上层液体，加入4 mL 培养基，移液管轻柔多次吹打，调整细胞密度，使细胞重新均匀悬浮后接种到培养皿中，于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养60 min 进行差速贴壁，吸出培养基，PBS 洗涤3 次去除血污，加入培养基继续培养细胞。

2.2 分组 将心肌成纤维细胞用含0.1% FBS、3%双抗的DMEM 高糖培养基培养6 h 进行同化实验。①对照组，不作任何处理；②AngⅡ组，1×10-7mol／L AngⅡ处理细胞1、24 h；③AngⅡ+五味子乙素低剂量组，1×10-7mol／LAngⅡ和2.5×10-5mol／L 五味子乙素处理细胞1、24 h；④AngⅡ+五味子乙素高剂量组，1×10-7mol／L AngⅡ和7.5×10-5mol／L 五味子乙素处理细胞1、24 h；⑤AngⅡ+雷帕霉素组，1×10-7mol／L AngⅡ和1×10-8mol／L 雷帕霉素处理细胞1、24 h。

2.3 Western blot 检测 BCA 蛋白浓度法测定心肌成纤维细胞总蛋白量。每个孔中加入50 μg 蛋白质，用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，1%BSA 磷酸盐缓冲液（PBST） 中室温封闭2 h，分别加入1 ∶1 000 兔抗mTOR、p-mTOR、AkT、TGFβ1、Collagen Ⅰ；1 ∶2 500 兔抗β-actin；1 ∶5 000 兔抗p-AkT，4 ℃冰箱中摇动孵育过夜，PBST 中洗膜10 min（3次），加入二抗（1 ∶3 500），室温下振摇2 h，PBST 洗膜10 min （3 次）。 然 后， 加 入 ECL 试 剂 发 光， 通 过FluorChem FC3 软件进行灰度值扫描，并分别与β-actin 灰度值比较。

2.4 统计学分析 通过SPSS17.0 软件处理，计量资料以表示，2 组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1细胞形态学特征 图1 显示，培养60 min 后大多数心肌成纤维细胞基本完成贴壁，生长出伪足且伸展为梭形，零星分散生长。心肌成纤维细胞生长迅速，可在2 ～3 d 内基本达到培养皿的80%～90%，细胞排列均匀紧密，没有自发性搏动，呈长梭形或者多边形，细胞体比较大且胞质澄明，细胞核清晰硕大。

图1 第2 代心肌成纤维细胞（×100）

3.2 五味子乙素对p-AkT 蛋白表达的影响 图2 显示，与对照组比较，Ang Ⅱ组p-AkT 蛋白表达显著下调 （P ＜0.05）；与AngⅡ组比较，AngⅡ+五味子乙素组其蛋白表达显著上调（P＜0.05）。

图2 五味子乙素对p-AkT 蛋白表达的影响

3.3 五味子乙素对p-mTOR 蛋白表达的影响 图3 显示，与对照组比较，AngⅡ组p-mTOR 蛋白表达显著上调（P＜0.05）；与AngⅡ组比较，AngⅡ+五味子乙素组其蛋白表达显著下调（P＜0.05）。

图3 五味子乙素对p-mTOR 蛋白表达的影响

3.4 五味子乙素对TGF-β1、CollagenⅠ蛋白表达的影响图4 显示，与对照组比较，AngⅡ组TGF-β1、CollagenⅠ蛋白表达显著上调（P＜0.05）；与AngⅡ组比较，AngⅡ+五味子乙素组两者蛋白表达显著下调（P＜0.05）。

4 讨论

本实验以AngⅡ为刺激因子建立心肌纤维化模型，发现与对照组比较处理后心肌成纤维细胞可使p-mTOR、TGF-β1 和CollagenⅠ表达明显升高，p-AkT 表达明显降低；与Ang Ⅱ组 比 较， 五 味 子 乙 素 组 （2.5×10-5、 7.5×10-5mol／L） 组发生明显逆转。由此证实，五味子乙素可呈剂量依赖性地下调p-mTOR、TGF-β1、CollagenⅠ蛋白表达，上调p-AKT 蛋白表达来改善AngⅡ诱导的心肌纤维化。

五味子性味酸、甘，温，归肺、心、肾经，功效收敛固涩、益气生津、补肾宁心［6］，具有安定心神的功效，适用于心神不安之失眠多梦、心悸等，对心气不足者，可补益心气［7］；对心肾阴虚者，又能滋养心肾，常与滋阴养血、补心安神之品配伍［8］。五味子乙素为五味子主要活性成分之一，对心肌缺血具有保护作用，可减轻氧自由基的侵害，抑制心肌细胞凋亡，维持心血管舒张功能，对DOX 诱导的心脏毒性具有保护作用［9］，还可通过降低TGF-β1 蛋白表达来起到抗肾纤维化的作用［10］。本实验发现，该成分可改善心肌纤维化。

当心肌损伤时，心肌成纤维细胞异常增殖，并分泌大量胶原蛋白，病理性细胞外基质积聚，引起心肌胶原过量聚集且胶原比列失调，最终导致心肌纤维化［11-12］；AngⅡ可促进心肌成纤维细胞增殖、分化、合成，并分泌大量细胞外基质蛋白，通过与其受体结合后能活化细胞内一系列信号通路，在心肌纤维化中具有重要作用［3］。 活化的mTOR 信号通路参与纤维化病变，抑制该信号通路时可通过减少细胞外基质表达来抑制纤维化形成［13］，它作为该信号通路中最主要的信号分子，参与了多种生理、病理过程，不仅具有蛋白激酶功能，而且在反映生长因子、营养状况的细胞信号传导途径中起着重要调控作用［14］，而且体外TGF-β1 诱导的原代人肺成纤维细胞纤维化模型与mTORC1活性升高，胶原、纤维黏连蛋白分泌增多有关［15］。本实验发现，五味子乙素可使mTOR 磷酸化水平降低，从而起到改善心肌纤维化的作用。

图4 五味子乙素对TGF-β1（A）、CollagenⅠ（B） 蛋白表达的影响

AkT 作为mTOR 信号通路的上游效应因子之一，参与心脏中多种细胞凋亡、代谢和心力衰竭发生发展［16］，有研究表明［17］，通过调控心肌细胞PI3K／AkT 信号通路可对AngⅡ诱导心肌细胞肥大起保护作用；本实验发现，AkT 参与心肌成纤维细胞中AngⅡ诱导的心肌纤维化。TGF-β 在细胞生长与分化、炎症、纤维化、肿瘤发生发展中发挥重要作用，其中与心肌纤维化密切相关的因子是TGF-β1，它可通过TGF-β／Smads 信号通路参与调节心肌成纤维细胞增殖、转化、迁移及细胞外基质合成与沉积，是促心肌纤维化的最主要因素之一［18-19］；本实验发现，五味子乙素在AngⅡ诱导的心肌纤维化中可通过下调TGF-β1 表达来发挥作用，而且TGF-β 与AngⅡ组成的工作网在纤维化形成中有着至关重要的作用，同时与其他信号通路相互影响［1］。雷帕霉素可抑制TGF-β 信号通路，并减少Collagen Ⅰ分泌［20］；本实验发现，该药物可使TGF-β1、CollagenⅠ蛋白表达降低，从而改善心肌纤维化。

综上所述，五味子乙素可通过促进AkT 磷酸化，抑制p-mTOR、TGF-β1 蛋白表达，减少CollagenⅠ合成，从而呈剂量依赖性的抑制AngⅡ诱导的心肌纤维化，可为该成分在心脏保护方面的研究提供参考，也为未来相关临床治疗拓展新思路。