复方芩柏颗粒剂对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中RORγt、Foxp3 表达的影响

李克亚， 王真权∗， 张佳敏

（1.湖南中医药大学第二附属医院肛肠三科，湖南 长沙410005；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

溃疡性结肠炎是一种原因不明的慢性直肠和结肠炎性疾病，其发病率逐年提高，但现代医学对其病因、病理机制尚不明确，导致临床治疗缺乏特异性［1-3］。中医药治疗溃疡性结肠炎的临床报道很多，均有一定疗效，但对其作用机理的探讨还不够深入，难以系统的现代科学和微观角度解释阐述，从而使其可信度不足，难以向社会推广［4-6］。

大多数溃疡性结肠炎发病与中医“湿热” “气滞” “血瘀” 等病机有关［7］，在此思路的启发下，课题组前期对古方止痛如神汤进行化裁，用具有清热利湿、行气止痛、化瘀止血功效的复方芩柏颗粒剂保留灌肠治疗；本实验基于前期动物实验及十多年临床研究，研究该制剂对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中RORγt、Foxp3 表达的影响，为进一步探讨其作用机制提供依据［8］。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雄性Wistar 大鼠，雌雄各半，60 只，体质量（220±10） g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（京） 2016-0011，动物质量合格证11400700254258，适应性喂养2～3 d。

1.2 模型建立［9］大鼠造模前禁食不禁水24 h，5%TNBS与无水乙醇按1 ∶1 体积配制成混合液。实验时腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL／kg） 麻醉大鼠，将一直径2.0 mm、长约12 cm 的硅胶管用石蜡油润滑，由肛门处轻缓插入大鼠体内约8 cm，按100 mg／kg 剂量对正常对照组、造模组大鼠分别缓慢注入生理盐水、混合液，提起尾部持续倒置10 min 以使造模剂充分渗入肠腔内，仰卧归笼，保温灯照射至大鼠自然苏醒，自由饮食。实验前随机抽取10 只造模大鼠，颈椎脱臼法处死后取其结肠组织，病理检查确认有充血、水肿、溃疡形成等溃疡性结肠炎典型病理变化时可认为造模成功。

1.3 试药及仪器 复方芩柏颗粒剂（湖南中医药大学第二附属医院肛肠科自制）。HE 染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。ELISA 试剂盒、DAB 显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；多功能酶标仪（美国BioTek 公司）；Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司）；逆转录试剂盒（A3500）、qPCR mix （A6001） （美国Promega 公司）；RORγt、Foxp3、β-actin 引物［生工生物工程（上海） 股份有限公司］；RIPA 蛋白裂解液（CW2334S）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（CW0014S）、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（CW0022） （北京康为世纪生物科技有限公司）；彩色预染蛋白Marker（加拿大Fermentas 公司）；ECL 发光检测试剂盒（美国Thermo Fisher 公司，35055）；RORγt 抗体（bs-10647R）、Foxp3 抗体（bs-0269R） （北京博奥森生物技术有限公司）；β-actin 抗体 （英国Abcam 公司，ab8227）；HRP 标记的羊抗鼠二抗（SA00001-1）、HRP 标记的羊抗兔二抗（SA00001-2） （武汉三鹰生物技术有限公司）。

2 方法

2.1 分组及给药 正常对照组、模型组、美沙拉嗪组于造模2 周后开始分别以蒸馏水、5%美沙拉嗪混悬液各2 mL灌肠，复方芩柏颗粒剂低、 中、 高剂量组分别以6%、12%、24%药物混悬液各2 mL 灌肠。各组每天给药2 次，连续3 周。

2.2 指标检测

2.2.1 一般情况 每天称取大鼠体质量，观察大便性状，检测便潜血，评估疾病活动指数（DAI），公式为DAI=体质量下降指数+大便性状+大便潜血。评分标准见表1。

表1 DAI 评分标准

2.2.2 血清TGF-β1、IL-17 水平检测 实验结束时麻醉大鼠，腹主动脉采血，2 500 r／min 离心10 min，收集血清液，置-20 ℃冰箱中保存备用，ELISA 法检测TGF-β1、IL-17水平。

2.2.3 结肠组织病理观察 选取大鼠结肠病变区组织，10%中性甲醛固定，梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，间断连续切5 μm 厚片，HE 染色，脱水，透明，封片，光学显微镜下观察结肠组织病理改变。

2.2.4 结肠组织中RORγt、Foxp3 蛋白表达检测 采用Westren-blot 法。取大鼠结肠组织，于液氮中研磨至粉末状，提取组织总蛋白，BCA 法测定蛋白量，取50 μg 上样，进行SDS-PAGE 电泳，转膜后封闭处理1 h，加入一抗RORγt、Foxp3、β-actin（1 ∶1000） 孵育过夜，二抗（1 ∶3 000） 室温孵育1 h，暗室加ECL 化学发光剂于化学发光仪成像，IPP6.0 图像分析软件对图像进行信号分析，计算目的蛋白／β-actin 蛋白比值。

2.2.5 结肠组织中RORγt、Foxp3 mRNA 表达检测 采用RT-PCR 法。Trizol 法提取细胞总RNA，超微量紫外分光光度计检测浓度后将1 μg 总RNA 逆转录合成cDNA，以其为模板采用荧光定量PCR 试剂盒进行扩增，操作均按照相应试剂盒说明书进行。qPCR 反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，循环40 次，以βactin 为内标，2-ΔΔCt法计算RORγt、Foxp3 相对表达，引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，序列见表2。

表2 PCR 引物序列

2.3 统计学分析 通过SPSS 21.0 软件进行处理，计量资料以表示，2 组间比较采用独立样本t 检验，而多组间比较前先进行方差齐性检验，方差齐时采用One-Way ANOVA 检验，LSD 法进行多重比较；方差不齐时采用非参数秩和检验，先用Kruskal-Wallis H 检验比较总差异，再用Mann-Whitney U 检验进行2 组间比较。另外，计数资料采用完全随机设计多样本比较的秩和检验。。

3 结果

3.1 复方芩柏颗粒剂对大鼠一般情况的影响 正常对照组大鼠反应灵活，皮毛浓密有光泽，饮食正常，大便成形呈褐色，活动无明显异常改变；模型组大鼠精神萎靡，皮毛易脱落，轻微竖毛，食量减少，便质软，有少量黏液或伴有血便，体重减轻；给药组大较模型组有不同程度的改善。图1 显示，与正常对照组比较，模型组大鼠DAI 评分显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，复方芩柏颗粒剂组该评分显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图1 各组大鼠DAI 评分

3.2 复方芩柏颗粒剂对TGF-β1、IL-17 水平的影响 图2显示，与正常对照组比较，模型组TGF-β1 水平显著降低（P＜0.01），IL-17 水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，复方芩柏颗粒剂高、中剂量组前者水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01），后者水平显著降低（P＜0.01），并呈一定量效关系。

3.3 复方芩柏颗粒剂对大鼠结肠组织病理变化的影响 肉眼显示，正常对照组大鼠结肠纹理清晰，无损伤；模型组大鼠结肠黏膜表面轻度充血、水肿，糜烂较局限，偶可见针尖样溃疡。光镜下（图3） 显示，正常对照组大鼠结肠各层组织结构完整清晰，腺体排列整齐，未见水肿、溃疡形成；模型组大鼠结肠黏膜结构破坏严重，部分区域黏膜脱落，腺体稀疏或缺失，排列紊乱，充血明显，并有局灶性出血，细胞间质可见炎性细胞浸润广泛，偶可见溃疡深达肌层；给药组大鼠实施情况均有不同程度的减轻，部分黏膜有浅表覆盖，轻度水肿，另一部分有肉芽组织增生，形成瘢痕。

3.4 复方芩柏颗粒剂对RORγt、 Foxp3 蛋白表达的影响 图4 显示，与正常对照组比较，模型组RORγt 蛋白表达显著升高（P ＜0.01），Foxp3 蛋白表达显著降低（P ＜0.01），两者比值明显失衡；与模型组比较，复方芩柏颗粒剂组前者蛋白表达（除低剂量组外） 显著降低（P＜0.01），后者蛋白表达及两者比值显著升高（P＜0.05，P＜0.01），并呈一定量效关系。

图2 各组TGF-β1、IL-17 水平

图3 各组大鼠结肠组织病理变化（HE 染色，×100）

3.5 复方芩柏颗粒剂对RORγt、Foxp3 mRNA 表达的影响 图5 显示，与正常对照组比较，模型组RORγt mRNA表达显著升高 （P ＜0.01），Foxp3 mRNA 表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，复方芩柏颗粒剂组前者mRNA表达显著降低（P＜0.01），后者mRNA 表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01），并呈一定量效关系。

4 讨论

IL-17 是新近发现的一种重要的促炎症细胞因子，具有强大的促炎反应活性，可通过增加细胞的通透性来促进其他前炎症因子和趋化因子产生，当它与受体结合后，可诱导活化T 细胞和刺激成纤维细胞、巨噬细胞和上皮细胞产生多种促炎介质（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、一氧化氮合酶2、单核细胞趋化蛋白-1 等），并通过联系体内适应免疫系统和固有免疫系统，介导溃疡性结肠炎等免疫疾病的发生发展过程［10-12］。TGF-β1 可由多种白细胞和间质细胞分泌产生，是重要的免疫调节分子，能通过调节特异性转录因子Foxp3 表达来影响Treg 细胞分化，并与维持外周Treg 细胞发育及功能活性密切相关，是诱导Treg 细胞生成所必需的，当外周淋巴器官中该信号受损时，Foxp3 表达减少，Treg 抑制功能减弱，最终导致自身免疫综合征［13-14］。目前认为，RORγt 和Foxp3 分别是控制Thl7／Treg 细胞分化的特异性转录因子，其中前者在Thl7 细胞分化过程中呈持续表达状态，并控制IL-17 表达过程；后者在CD4+CD25+Treg细胞分化过程中呈特异性高表达，可调控Treg 细胞分化发育和功能，该基因突变或敲除小鼠会导致CD4+CD25+Treg细胞缺失或下降，伴有功能缺陷，诱发严重自身免疫反应［15-16］。

图4 各组RORγt、Foxp3 蛋白表达

图5 各组RORγt、Foxp3 mRNA 表达

复方芩柏颗粒剂及其制备工艺已于2000 年获得中华人民共和国国家知识专利（专利号ZL941131149），是在古方止痛如神汤的基础上进行化裁，主要由黄芩、黄柏、秦艽、桃仁、防风、泽泻、当归、制大黄、玄胡、生地、槟榔11味中药组成，方中黄芩、黄柏清热燥湿；大黄泻火解毒，活血祛瘀；当归、生地补血活血；桃仁活血祛瘀；玄胡、槟榔活血行气止痛；防风、秦艽胜湿止痛；泽泻清热利湿，诸药合用，补泻并举，泻中有补，共奏清热利湿、行气止痛、化瘀止血之功效，主治与“湿热” “气滞” “血瘀” 等病机有关的疾病。本实验发现，复方芩柏颗粒剂能在一定程度上改善溃疡性结肠炎大鼠症状，其机制可能是通过上调TGF-β1 表达，调控RORγt、Foxp3 的平衡，进而下调IL-17 表达，从而改善炎症，并呈一定剂量关系，为其临床推广应用提供实验依据。但该方对溃疡性结肠炎的作用靶点是否是多途径的尚不明确，还需要作进一步研究。