不同产地刺五加UPLC 指纹图谱

王东晗， 梁宇飞， 张欣欣， 赵丽艳， 李亚鑫， 张丹参， 张万明

（河北北方学院药学系，河北省神经药理学重点实验室，河北 张家口075000）

刺五加为五加科植物刺五加Acanthopanax seuticosus（Rupr.et Maxim.）Harms 的干燥根、根茎及茎，又名五加参、西伯利亚参，别名刺拐棒、老虎潦、一百针等［1］。刺五加主要分布在我国北方的东三省、河北和山西。其性味辛、温、微苦，有益气健脾、补肾安神的功效，常用于治疗脾肺气虚、体虚乏力、食欲不振、肺肾两虚、久咳虚喘、肾虚腰膝酸痛、心脾不足、失眠多梦［2］。现代药理学研究表明， 刺五加具有抗肿瘤［3-5］、 抗抑郁［6-7］、 抗 疲 劳［8］、 扩 张 心 脑 血 管［9］、 免 疫 调节［10-11］等作用。于丽云等［12］通过高效液相色谱法测定了不同生长年限、不同环境、不同部位刺五加中异嗪皮啶的含有量；姚慧敏等［13］采用超高效液相色谱-紫外检测器同时测定了野生刺五加中紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷E、异嗪皮啶和槲皮素-3-鼠李糖苷的含有量。几种化学成分表征中药质量的质控方法，无法全面表征中药材化学成分群的整体性和复杂性，难以全面控制刺五加的内在质量［14］。中药指纹图谱立足于中药化学成分系统研究，在中药材及中药制剂的质量控制与评价方面应用广泛［15-16］。已有的对刺五加指纹图谱的研究中［17-18］，所建立的HPLC 指纹图谱分析时间长，药材选用的产地比较少，没有很好的代表性。本研究收集了24 批刺五加样品来源于主产地，建立其UPLC 指纹图谱，共有峰数目多，分析时间大大缩短，并对不同产地该药材进行比较，以期明确各产地药材相似度，为其质量控制奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Waters ACQUITY 超高效液相色谱仪（自动进样器，在线脱气系统，二极管阵列检测器，Empower3 色谱工作站， 美国Waters 公司）；ME235P 型电子分析天平（1／10 万，德国Sartorius公司）；UPT-I-60 L 优普系列超纯水机（成都超纯科技有限公司）； 电热恒温鼓风干燥箱DHG-9140AS（宁波江南仪器厂）；GAOKE 旋转蒸发仪（巩义市英峪高科仪器厂）；Sigma4-15 低速冷冻离心机（美国Sigma 公司）；CY-5000 型数控超声波发生器（宁波新芝仪器有限公司）。

1.2 试药 异嗪皮啶对照品 （批号110837-201608，含有量100.0%）、原儿茶酸对照品（批号110809-201205，含有量99.9%）、绿原酸对照品（批号110753-201716，含有量99.3%） 均购自中国食品药品检定研究院；紫丁香苷对照品（批号16060805，含有量大于98%，上海安奈德化学技术中心）。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。刺五加样品来源于该药材主产地黑龙江、吉林、辽宁、河北、山西等地，见表1。经河北北方学院中药研究所马淑兰教授鉴定为正品，刺五加药材于电热恒温鼓风干燥箱中干燥后，中药粉碎机粉碎，过3 号筛，备用。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相乙腈（A） -0.3%冰乙酸水溶液（B），梯度洗脱（0 ～7 min，95%→80%B；7 ～11 min，80%→70%B；11 ～12 min，70%→60%B）；检测波长为原儿茶酸257 nm、绿原酸324 nm、紫丁香苷267 nm、异嗪皮啶220 nm；体积流量0.3 mL／min；柱温30 ℃；进样量2 μL。

2.2 供试品溶液制备 精密称定各产地刺五加粉末1 g， 置于锥形瓶中， 加入72%甲醇15 mL，67 ℃超声（功率560 W） 提取2 次，2 h／次，合并上清液，旋转蒸发至干燥，再用10 mL 20%乙醇溶解，备用。

2.3 对照品溶液制备 精密称取原儿茶酸、绿原酸、紫丁香苷和异嗪皮啶对照品各适量，用20%乙醇溶解并稀释成质量浓度分别为118、198、186、98 μg／mL 的溶液，作为贮备液，备用。

2.4 方法学考察［19］

2.4.1 精密度试验 精密称定吉林产刺五加药材粉末适量，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下，连续进样6 针，以紫丁香苷的色谱峰为参照峰，得17 个共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD 分别小于1.0%、2.0%，表明该仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 精密称定吉林产刺五加药材粉末适量，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，室温放置，在“2.1” 项色谱条件下，分别于0、3、6、9、12、15 h 进样2 μL。以紫丁香苷色谱峰为参照峰进行测定。17 个共有峰在15 h 内的相对峰面积RSD 小于3.0%，相对保留时间RSD 小于1.0%，表明供试品溶液在15 h 内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 精密称取同一产地刺五加药材粉末（产地吉林） 6 份，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样，以紫丁香苷为参照峰，得到刺五加药材17 个共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD 分别小于5.0%、1.0%，表明该方法重复性良好。

2.5 指纹图谱建立［19-20］

2.5.1 共有峰标定及参照峰选择 精密称取24 批不同产地样品粉末各1 g，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样，提取各产地刺五加335 nm 处的色谱图，将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012 版） ”，生成指纹图谱共有模式和对照指纹图谱，并标定共有峰17 个，见图1 ～2。精密吸取混合对照品溶液进行测定，通过与对照品保留时间比对，指认了指纹图谱17 个共有峰中的原儿茶酸（1 号峰）、绿原酸 （5 号峰）、紫丁香苷 （6 号峰）、异嗪皮啶（11 号峰），见图3。6 号峰紫丁香苷峰形好，峰面积稳定，分离度较好，且为刺五加中主要药理活性成分之一，故选定为UPLC 特征图谱的参照峰。以紫丁香苷为参照峰，计算17 个共有峰相对保留时间和相对峰面积，结果见表2～3。

图1 24 批样品UPLC 指纹图谱Fig.1 UPLC fingerprints of twenty-four batches of samples

表2 24 批样品共有峰相对保留时间Tab.2 Relative retention time of common peaks of twenty-four batches of samples

续表2

表3 24 批样品共有峰相对峰面积Tab.3 Relative peak areas of common peaks of twenty-four batches of samples

图2 样品对照UPLC 指纹图谱Fig.2 Reference UPLC fingerprint of samples

2.5.2 相似度评价 应用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件 （2012 版） ” 对24 批样品UPLC 指纹图谱进行相似性分析，结果表明，16 批样品的相似度在0.950 以上，其余8 批相似度小于0.950，表明不同产地间的刺五加具有一定的差异性。见表4。

表4 24 批样品相似度Tab.4 Similarities of twenty-four batches of samples

2.5.3 聚类分析 以所测24 批样品中标定的共有峰峰面积为变量，运用SPSS 21.0 统计学软件中的离差平方和法进行聚类分析，标准化数据选择全距从0～1，样品测度选择平均欧氏距离，见图4。结果表明，24 批样品被分为4 类，S1、S2、S4、S5、S8、S9、S11、S16 聚为一类；S12、S15、S24 聚为一类；S14 单独为一类；其余样品聚为一类，此结果与指纹图谱相似度分析结果相似。

图4 24 批样品聚类树状图Fig.4 Dendrogram of twenty-four batches of samples

3 讨论

本研究在样本收集方面覆盖了多数刺五加产地，包括河北、山西、黑龙江、吉林、辽宁等。样本收集具有地域代表性、收集范围广泛，从而确保了刺五加药材指纹图谱生成的科学性。

在单因素考察的基础上运用Box-Behnken 中心组合设计，以提取时间、提取温度和甲醇体积分数为自变量，进行3 因素3 水平响应面优化设计，最终确定了“2.2” 项下刺五加供试品溶液的制备方法。

在刺五加药材的指纹图谱研究中，应用光电二极管阵列检测器比较了在210 ～400 nm 之间不同扫描波长对吸收峰的数量、强弱及分离情况。结果表明，在335 nm 检测波长下，吸收峰数量多、峰强度大、各色谱峰分布均匀、峰形大小合适、基线平稳，可以表达刺五加各类成分的出峰情况。此外，还比较了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%冰乙酸水、乙腈-0.2%冰乙酸水等不同流动相进行梯度洗脱时峰的分离度和峰形。显示乙腈-0.3%冰乙酸水为流动相时峰的分离度与峰形良好。实验时，以梯度洗脱程序运行12 min，为确保色谱图基线的稳定，每次进样前用初始流动相平衡5 min。

本研究首次对刺五加药材UPLC 指纹图谱进行了相似度评价和聚类分析，标定了17 个共有峰，4个已确认成分；通过对比不同产地刺五加指纹图谱的相似度发现，24 批样品相似度存在一定差异；聚类结果将24 批样品分为4 类。分析结果显示，不同产地刺五加药材受地域影响较大。该方法专属性强、精密度高、重复性好，操作简便，有利于确保产品质量的稳定、均一，以期为刺五加的质量控制提供指导和依据。