基于特征图谱分析市售决明子质量现状

杨东方， 胡云飞， 蔡翠芳， 姚雪峰， 夏成凯， 王 玲

（1.山西药科职业学院，山西 太原030031；2.安徽中医药科学院亳州中医药研究所，安徽 亳州236800；3.合肥市食品药品检验中心，安徽 合肥230000；4.安徽中医药大学，安徽 合肥230031）

决明子为豆科植物决明Cassia obtusifolia Linn.或小决明Cassia tora Linn.的干燥成熟种子，以其有明目之功而名之，临床上用于目赤涩痛、羞明多泪、目暗不明、大便秘结等症［1］。广泛应用于临床配方、中成药及保健品生产原料［2］。近年来，随着贸易全球化的不断推进，市场上出现了越来越多的非常规进口药（如决明子、甘草等）［3］。这些“洋中药” 凭借其价格低廉占据了国内中药材市场半壁河山，由于其基原难以确定［4］，质量参差不齐，严重影响了决明子等药材的质量稳定性，进而难以确保临床用药安全、有效。

中药临床疗效取决于其含有的有效成分（群）特征［5］。决明子中化学成分群因其种属及产地不同存在不同程度的差异，也势必会对其临床疗效产生较大影响［6］。本实验对市售决明子进行调查，收集决明子药材样品22 批，包括其主产区广西、河南、安徽等。通过建立决明子特征图谱，探讨其药材质量一致性。并同时测定决明子中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、橙黄决明素的含有量，初步形成多指标成分综合评价体系。

相似度分析、主成分分析是目前普遍应用于中药复杂体系分析的化学计量学方法［7-8］。本研究相似度分析采用国家药典委员会研发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012 版” 软件，该软件运算采用夹角余弦法，能定量地表征各样品间的相似程度 （或差异性）； 主成分分析采用瑞典Umetrics 公司的SIMCA-P 软件，提供了主成分分析等模型的有效算法。通过运用化学计量学方法对决明子特征图谱、含有量测定结果进行分析，以期为决明子的品质鉴定、质量评价及规范市场经营提供了科学依据。

1 材料

1.1 仪器 Waterse2695 高效液相色谱 （美国Waters 公司）；Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Waters 公司）；XP26 型分析天平 （百万分之一， 德国Mettler toledo 公司）；S30H-D78224 型超声清洗器 （德国 Elma Sonic公司）。

1.2 试剂与试药 对照品大黄酸（批号110757-201607，含有量99.3%）、 大黄素甲醚 （批号110758-200610，含有量98.6%）、 大黄素 （批号110756-201512，含有量98.7%）、橙黄决明素（批号111900-201605，含有量98.3%）、大黄酚（批号110796-201520，含有量99.2%），均购于中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，美国Tedia有限公司）；乙醇、磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水（屈臣氏公司）。

22 批决明子除7 批收集于河南、安徽等产地外，其他样品购自于安徽亳州、河北安国及当地药材市场。本实验中样品均由安徽中医药大学周建理教授鉴定均为豆科植物决明Cassia obtusifolia Linn.的干燥成熟种子，信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 供试品溶液制备 取决明子样品干燥粉末（过3 号筛） 约1.00 g，精密称定，置50 mL 锥形瓶中，加70%乙醇20 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再次称定质量，用70%乙醇水溶液补足减失质量，摇匀，用0.22 μm 有机滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 对照品溶液制备 精密称取橙黄决明素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量（以对照品含有量标示折算），置50 mL 量瓶中，加70%乙醇至刻度，配制成质量浓度分别为0.056 6、0.220 0、0.136 0、0.063 0、0.290 0 mg／mL 的混合对照品贮备液。

2.3 色谱条件 Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈 （A） -0.05%磷酸（B），梯度洗脱，洗脱程序见表2；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL／min；波长285 nm；进样量10.0 μL。在上述色谱条件下，色谱图见图1。

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution programs

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液0.5、1、2、5、10 mL 置10 mL 量瓶中，用70%乙醇定容至10 mL，混匀，得到一系列不同质量浓度的混合对照品溶液 （B1、 B2、 B3、 B4、B5）。在“2.3” 项色谱条件下进样，以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X） 进行回归。结果见表3。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液（B3）5.0 μL，在“2.3” 项色谱条件下连续进样6 次， 测得各化合物峰面积RSD 0.46% ～1.65%，表明该仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取决明子供试品溶液（J7），在“2.3” 项色谱条件下， 分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，测得各化合物峰面积RSD 0.35%～1.89%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性较好。

2.4.4 重复性试验 取同一批样品（J7） 粉末6份，分别按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，测得各成分含有量平均值RSD 0.22%～0.95%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取已知含有量的J7 样品约0.5 g，精密称定，分别精密加入混合对照品贮备液适量，按“2.1” 项下方法平行制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样，计算加样回收率。得各成分平均回收率95.6%～101.3%，RSD 0.45%～3.62%。

2.5 样品含有量测定 取22 批样品，按“2.1”项下方法平行制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样，测定待测化合物的峰面积，根据对照品的峰面积采用外标法计算各化合物含有量，见表4。

表4 各成分含有量测定结果（mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g）

2.6 化学计量学分析

2.6.1 相似度分析 在各批次决明子药材色谱中大黄素的色谱峰（3 号） 分离良好，峰面积较大，为所有样品所共有，所以确定其为参考峰。将决明子样品色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012 版” 软件，建立了决明子的特征图谱的共有模式图，确认了25 个共有峰，并对22 批样品的图谱进行相似度评价，结果见图2、表5。

图2 22 批样品HPLC 指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprints of twenty-two batches of samples

2.6.2 主成分分析 将分析数据导入SIMCA-P 13.0 版软件，以决明子中各成分含有量为X 变量，以样品22 个批次为Y 变量，以样本成分的含有量为特征值，将数据标准化后进行无监督的PCA。见图3，可知不同产地的药材在主成分空间的分布上有各自的特定区域，进口（未知） 与越南产在分布上有区域交叉，河南产与安徽较接近，安徽产又与广西产较接近，湖北产、湖南产、山东与其他产地较为疏远，可能是由于受地理、气候等因素影响，其化学成分的富集也有所不同。

3 讨论

3.1 提取条件选择 本研究对提取方法及溶剂进行了考察，首先探讨对决明子样品前处理是否脱脂，结果表明不脱脂实验效果较好。通过对提取方法与溶剂进行选择，结果表明采用70%乙醇溶液提取效果较好，特征图谱信息丰富；通过采用同一提取溶剂，同一提取时间，不同的提取方法，结果表明索氏提取效率略高于超声提取，考虑经济等因素，采用超声提取法操作简便，高效；通过对超声时间进行了考察，超声提取30 min 最佳。

表5 22 批样品相似度Tab.5 Similarities of twenty-two batches of samples

图3 22 批样品主成分分析图Fig.3 PCA plot for twenty-two batches of samples

3.2 色谱条件优化 本实验比较了甲醇、乙腈等不同比例的流动相系统，不同类型的色谱柱，选用乙腈-0.05%磷酸水与Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 能将决明子不同成分色谱峰进行很好的分离。采用二极管阵列检测器考察190 ～700 nm 不同检测波长图谱，综合考虑到决明子化学成分类型，选择285 nm 作为检测波长。

3.3 结果分析 本实验建立决明子药材的特征图谱和5 个化合物含有量测定方法。结果表明不同产地样品特征图谱大致相同，不同产地决明子所含化学成分大致相同，但部分样品相似度较低，可能在含有量上有所差别。依据《HPLC 指纹图谱建立的技术要求》，相似度应大于0.90，根据图5 中相似度评价数据是否可以将相似度阈值适当降低（如0.85），有待于进一步研究。对各化合物含有量进行分析，不同产地样品可以聚集到各自特定的区域，表明决明子的化学成分与其产地、地理位置等生态环境存在一定的相关性。

2015 版《中国药典》 一部规定决明子药材按干燥品计算［9］，药材中含大黄酚不得少于0.20%、橙黄决明素不得少于0.080%。22 批样品中橙黄决明素合格15 批，大黄酚合格5 批，两者均合格仅有3 批，这也证实了目前市场上普遍反映决明子不合格的现状［10］。相比于其他国家及地区标准，《中国药典》 的含有量限定值较高［其中《香港中药材标准》 （第三册）［11］仅规定橙黄决明素不得少于0.017%，《第十五改正日本药局方》［12］未规定决明子含有量限值］。如何制定科学、合理的中药材质量标准成为了研究热点［13-14］，徐风等［15］提出中药药效物质的“显效形式” “叠加作用” “毒性分散效应” 假说，中药药效可能是一类化合物的共同作用效果，决明子中含有众多蒽醌类化合物，除橙黄决明素、大黄酚外，还有大黄素、大黄素甲醚等，因而决明子未来质量标准修订是否可以总蒽醌量作为评价指标，将有待进一步研究。

本实验对市售决明子的质量现状进行初步研究，发现市售决明子来源广泛，质量良莠不齐，进口决明子已成为临床用药的重要组成部分，部分进口药材质量较差甚至难以确定其产地，这也给市场监管提出了挑战。本研究建立了特征图谱、多指标含有量测定的分析方法，为进一步完善决明子的质量标准提供了科学依据。

致谢本研究得到了安徽中医药大学周建理教授、亳州学院卢宝伟副教授的大力支持与帮助。