蝼蛄化学成分及其抗菌活性

刘年珍， 何雨晴，2， 卢辛甜，2， 赵碧清，2∗， 周小江，2∗

（1.湖南中医药大学，湖南长沙410208；2.湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心，湖南长沙410208）

蝼蛄收载于1980 年版《新疆维吾尔自治区药品标准》，为蝼蛄科昆虫蝼蛄Gryllotalpa africana Palisot et Beauvois 的干燥虫体。蝼蛄药用历史悠久，始载于《吕氏春秋》，称为蝼蝈， 《神农本草经》 记载“蝼蛄味咸性寒，主产难，出肉刺，溃痈肿，下哽噎，解毒，除恶疮”； 《本草图经》 记载“利大小便，治口疮立效”；《本草纲目》 记载蝼蛄“利大小便，通石淋，治瘰疬，骨鲠”； 《千金方》 记载“塞耳治聋”［1］。蝼蛄在临床上主要用于治疗肾炎、大小便不通、水肿、肝硬化腹水症、尿 潴 留、 泌 尿 系 统 结 石、 痈 肿、 瘰 疬、 恶 疮等［1-3］。其水提液具有利尿和镇静作用［4］。其主要含有蛋白质、氨基酸、脂肪酸、甾醇、生物碱等成分［5-8］。

蝼蛄作为动物类中药，其临床疗效较好，但对其成分研究不多。为了诠释其作用物质基础，特对其化学成分及抗菌活性进行研究，从中分离得6 个化合物，所有化合物均为首次从蝼蛄中分离得到，其中化合物4～5 为其抗菌活性成分。

1 材料

Bruker DRX-600 MHz 核磁共振波谱仪（德国Bruker 公司，TMS 为内标）；高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Büchi 型旋转蒸发仪（瑞士Buchi公 司）； Sephadex LH-20 （美 国 Amersham Biosciences 公司）；Rp-18 反相硅胶（40 ～63 μm，日本Daiso 公司）；D101 大孔吸附树脂（天津允开公司）；色谱硅胶（200 ～300 目）、硅胶H 和薄层色谱硅胶GF254（青岛海洋化工厂）。所用试剂均为分析纯。

供试菌株为真菌薯蓣炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides，由海南大学热带农林学院薯蓣课题组提供。

蝼蛄药材购买自湖南振兴中药饮片实业有限公司，经湖南中医药大学中药鉴定教研室周小江教授鉴定为蝼蛄科昆虫蝼蛄Gryllotalpa africana Palisot et Beauvois 的干燥虫体。标本存放在湖南中医药大学含浦校区二号实验楼C 栋427 室。

2 提取与分离

蝼蛄药材10 kg 加6 倍量70%乙醇回流提取3次，1 h／次，过滤，合并滤液，减压回收乙醇并浓缩，得浓缩液。将浓缩液加于已用蒸馏水平衡好的大孔吸附树脂 （HP-20） 柱上， 分别用30%、50%、70%、90%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，合并70%、90%乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，得浸膏约60 g。浸膏拌样，加于正相硅胶柱色谱柱上，石油醚-乙酸乙酯-甲醇（70 ∶30 ∶0～70 ∶30 ∶35） 梯度洗脱，收集洗脱液，每份约500 mL，检识，合并成5 部分（Fr.1～Fr.5）。

Fr.3（4.8 g） 过MCI 柱，甲醇-水梯度洗脱，检识，合并成3 部分 （Fr.3-1 ～Fr.3-3）。Fr.3-2（0.4 g） 经Sephadex LH-20 凝胶柱和高效液相色谱［甲醇-水（78 ∶22） ］，得化合物6 （4.3 mg）。Fr.3-3（1.3 g） 过Sephadex LH-20 凝胶柱色谱，甲醇洗脱，检识，合并成4 部分（Fr.3-3-1 ～Fr.3-3-4），Fr.3-3-1（0.08 g） 经高效液相色谱［甲醇-水（59 ∶41） ］， 得化合物3 （2.5 mg）。 Fr.3-3-2（0.14 g） 经制备薄层（PTLC） ［三氯甲烷-丙酮（1 ∶5） 为展开剂］ 和高效液相色谱 ［甲醇-水（62 ∶38） ］， 得化合物1 （2.1 mg）。 Fr.3-3-4（0.19 g）经制备薄层（PTLC） ［石油醚-乙酸乙酯（10 ∶3） 为展开剂］ 和高效液相色谱［甲醇-水（58 ∶42） ］，得化合物5（4.0 mg）。Fr. 4（7.5 g）过MCI 柱色谱，甲醇-水梯度洗脱，检识，合并成2 部分（Fr.4-1、Fr.4-2）。Fr.4-2（2.1 g） 先过正相硅胶柱色谱［石油醚-乙酸乙酯梯度（4 ∶1 ～1 ∶2）洗脱］，再经高效液相色谱［甲醇-水（76 ∶24） ］，得化合物4（10.2 mg） 和2（3.0 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：红色固体，易溶于三氯甲烷、甲醇， 硫 酸-乙 醇 显 黄 色。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：8.02（1H，d，J=8.7 Hz，H-8），7.48（1H，s，H-4），7.22（1H，d，J=2.5 Hz，H-5），6.91（1H，dd，J=8.7，2.5 Hz，H-7），5.15（1H，d，J=7.7 Hz，H-1′），2.23（3H，s，CH3）； 13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：187.9（C-9），185.3（C-10），164.9（C-1），163.2（C-6），161.7（C-3），137.3（C-4a），134.1（C-10a），130.9（C-8），125.1（C-8a），124.9（C-7），120.0（C-2），117.9（C-5），112.9（C-9a），106.3（C-4），101.7（C-1′），78.4 （C-5′），78.2 （C-3′），75.0 （C-2′），71.1（C-4′），62.3（C-6′），8.5（-CH3）。以上数据与文献［9］ 一致，故鉴定为2-甲基-1，6-二羟基蒽醌-3-O-β-葡萄糖苷。

化合物2：浅黄色固体，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显黄色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：8.15（1H，d，J=8.5 Hz，H-8），7.51（1H，d，J=2.6 Hz，H-5），7.22（1H，s，H-4），7.16（1H，dd，J=8.6，2.6 Hz，H-7），2.15（3H，s，CH3）； 13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：187.8（C-9），184.2（C-10），165.0（C-3），164.3（C-1），163.8（C-6），137.2（C-10a），133.9（C-4a），130.7（C-8），127.0（C-8a），122.3（C-7），119.6（C-2），113.9（C-5），110.6（C-9a），108.2（C-4），8.3（-CH3）。以上数据与文献［10］ 一致，故鉴定为2-甲基-1，3，6-三羟基蒽醌。

化合物3：浅黄色固体，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显黄色。 1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.98（1H，d，J=8.7 Hz，H-8），7.42（1H，s，H-4），7.27（1H，d，J=2.5 Hz，H-5），6.85（1H，dd，J=8.8，2.5 Hz，H-7），5.39（1H，d，J=7.6 Hz，H-1′），5.37（1H，d，J=2.1 Hz，H-1″），2.22（3H，s，CH3），1.16（3H，d，J=6.2 Hz，rham-CH3）； 13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：187.8（C-9），185.7（C-10），163.2（C-1），163.1（C-6），161.1 （C-3）， 137.3 （C-4a）， 134.0 （C-10a），131.1（C-8），125.8（C-8a），122.8（C-7），120.8（C-2），112.8（C-5），111.6（C-9a），105.8（C-4），102.5（C-1″），99.6（C-1′），79.7（C-5′），79.3（C-3′），78.2（C-2′），74.1（C-4″），72.5（C-2″），72.2 （C-3″），71.3 （C-4′），70.3 （C-5″），62.9（C-6′），18.4（C-6″），9.3（-CH3）。以上数据与文献［9］ 一致，故鉴定为2-甲基-1，6-二羟基蒽醌-3-O-β-葡萄糖-（2′→1″） -α-鼠李糖苷。

化合物4：浅黄色固体，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显紫红色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：9.77（1H，s，H-8），8.69（1H，s，H-13），8.11（1H，d，J=9.0 Hz，H-11），7.99（1H，d，J=8.9 Hz，H-12），7.65（1H，s，H-1），6.96（1H，s，H-4），6.11（2H，s，-OCH2O），4.92（2H，t，J=5.4 Hz，H-6），4.20（3H，s，9-OCH3），4.10（3H，s，10-OCH3），3.25（2H，t，J=5.4 Hz，H-5）； 13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：152.3（C-10），152.2（C-3），150.1（C-2），146.5（C-9），145.8（C-8），139.8（C-13a），135.3（C-12a），132.0（C-4a），128.0（C-11）， 124.5 （C-12）， 123.4 （C-8a），122.0（C-13b），121.5 （C-13），109.4 （C-4），106.6（C-1），103.7（-OCH2O），62.6（9-OCH3），57.6（10-OCH3），57.2（C-6），28.2（C-5）。以上数据与文献［11］ 一致，故鉴定为小檗碱。

化合物5：浅黄色固体，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显紫红色。 1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：9.78（1H，s，H-8），8.82（1H，s，H-13），8.13（1H，d，J=9.1 Hz，H-11），8.02（1H，d，J=9.0 Hz，H-12），7.68（1H，s，H-1），7.06（1H，s，H-4），4.91（2H，t，J=5.4 Hz，H-6），4.21（3H，s，9-OCH3），4.12（3H，s，10-OCH3），3.99（3H，s，2-OCH3），3.95（3H，s，3-OCH3）3.31（2H，t，J=5.4 Hz，H-5）； 13C-NMR（150 MHz，CD3OD） δ：154.0（C-3），152.1（C-10），151.1（C-2），146.6（C-8），145.9（C-9），140.0（C-13a），135.4（C-12a），130.2（C-4a），128.2（C-12），124.6（C-11），123.5（C-13b），121.4（C-13），120.6（C-8a），112.3（C-4），110.0（C-1），62.7（9-OCH3），57.7 （10-OCH3）， 57.3 （2-OCH3）， 57.0 （3-OCH3），56.7（C-6），27.8（C-5）。以上数据与文献［12］ 一致，故鉴定为巴马汀。

化合物6：浅黄色固体，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇显黄色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：8.12（1H，d，J=8.7 Hz，H-8），7.50（1H，d，J=2.5 Hz，H-5），7.42（1H，s，H-4），7.18（1H，dd，J=8.7，2.5 Hz，H-7），5.42（1H，d，J=7.6 Hz，H-1′），5.39（1H，d，J=2.1 Hz，H-1″），2.23（3H，s，-COCH3），1.97（3H，s，2-CH3），1.17（3H，d，J=6.2 Hz，H-6″）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：187.8（C-9），185.6（C-10），181.0（-COCH3），163.2（C-1），161.1（C-6），161.1（C-3），137.3（C-4a），134.0（C-10a），131.1（C-8），131.1（C-8a），122.8（C-7），117.0（C-2），112.8（C-5），112.8（C-9a），105.9（C-4），102.5（C-1″），99.6 （C-1′），79.7 （C-3′），79.3 （C-2′），78.3（C-5′），74.1（C-4″），72.9（C-2″），72.5（C-3″），72.2 （C-4′），71.3 （C-5″），70.3 （C-6′），21.8（-COCH3），18.3（C-6″），9.3（-CH3）。以上数据与文献［10］ 一致，故鉴定为2-methyl-1，6-dihydroxy-9，10-anthraquinone-3-O-（6′-O-acetyl） -α-L-rhamnosyl-（1″→2′） -β-D-glucoside。

4 抗菌活性筛选

4.1 方法［13］

4.1.1 抑菌活性 阳性对照品为放线菌酮，空白对照品为色谱甲醇。供试菌株由于低温（-10 ℃）保存，在活性检测前需进行活化。制备土豆固体培养基并灭菌制成平板备用，挑取供试菌株菌丝体置于培养基中，于25 ℃无菌室中静置48 h。制备土豆液体培养基并灭菌置于离心管中备用，挑取已活化的菌丝体置于离心管中，于摇床上（25 ℃，暗处） 振摇24 h。将已制备好的菌液用灭菌棉签均匀涂板，用镊子夹取直径6 mm 的无菌滤纸片放在平板中浸泡。将所得化合物和放线菌酮分别用甲醇溶解并配成1 mg／mL 溶液。各吸取10 μL 置于滤纸上，密封后于25 ℃无菌室中静置48 h 后观察。

4.1.2 最小抑菌浓度 采用96 孔板法，将化合物4 ～5 分别配成1 mg／mL 溶液， 吸取640 μL 加360 μL甲醇定容至640 μg／mL，质量浓度依次呈0.5 倍梯度稀释10 次至1.25 μg／mL，用空白培养基和甲醇溶液作对照，制备土豆液体培养基并灭菌备用。将稀释好的样品和对照品分别吸取10 μL 置于已加入10 μL 培养液的96 孔板中。密封后于25 ℃无菌室中静置48 h 后观察。

4.2 结果

4.2.1 抑菌活性 实验结果见图1。结果表明，化合物4～5 具有一定的抑菌活性。

图1 抑菌实验结果Fig.1 Results of bacteriostasis experiment

4.2.2 最小抑菌浓度 结果显示，化合物5 在640 μg／mL 以下无明显抑菌活性， 化合物4 在320 μg／mL 以上有一定的抗病原真菌薯蓣炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides 活性，化合物4 最小抑菌浓度为320 μg／mL。

5 讨论

本研究首次从蝼蛄中分离和鉴定了4 种蒽醌类和2 种生物碱类成分，且化合物4 ～5 为抗菌活性成分，这为研究其临床治疗肾炎等的物质基础奠定了基础。动物药主要含有蛋白质等大分子类成分［14-15］，本实验针对小分子化合物进行研究，并找出具有抗菌活性的小分子化合物，以期丰富动物药的研究思路。蝼蛄为动物药，本研究从中发现了蒽醌类和生物碱类成分，并且有小檗碱和巴马汀，推测这些化合物与其食物来源相关。