杠板归乙醇提取物对化学性肝损伤小鼠的保护作用

何国鑫， 邓青芳， 陈华国， 赵丹妮， 周 欣∗

（1.贵州师范大学贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州 贵阳550001；2.贵州师范大学贵州省药物质量控制及评价技术工程实验室，贵州贵阳550001；3.贵州师范大学天然药物质量控制中心，贵州 贵阳550001）

肝脏是体内新陈代谢的中心站，具有十分重要和复杂的生理功能［1］，易受病原体、有毒物质、免疫病理等影响，流行性医学研究表明，肝病的发病率不断攀升，严重危害人类身体健康和生活质量。肝损伤是各种肝脏疾病共有的一种病理状态，其持续恶化会导致肝硬化、肝纤维化、肝癌等［2］。

杠板归为多年生蔓生草本蓼科植物杠板归Polygonum perfoliatum L.的干燥地上部分，具有清热解毒、利水消肿、保肝、止咳等功效［3］，在治疗肝损伤方面有一定功效［4-8］，但肝损伤同时是否会对其上下游器官——心脏和肾脏造成影响尚不清楚。因此，本实验考察杠板归乙醇提取物对化学性肝损伤小鼠的保护作用，对于阐明该药材肝损伤作用机制具有重要意义，也为其深入研究与相关产品开发提供参考。

1 材料

1.1 药材 杠板归购自贵州省安顺市静宁县，经贵州师范大学陈华国教授鉴定为杠板归Polygonum perfoliatum L.的干燥全草。

1.2 动物 SPF 级雄性KM 小鼠，体质量18 ～22 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司［许可证号SCXK（湘）2014-0011］。

1.3 试剂 联苯双酯滴丸（浙江万邦药业股份有限公司，批号A02J151230）；谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA） 试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.4 仪器 万分之一天平［梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司，型号AL204］；酶标仪（美国Moleaular Devices 公司，型号Max Plus 384）；倒置荧光显微镜（广州市明美光电技术有限公司，型号MF53）。

2 方法

2.1 供试药制备 取1 kg 药材粉碎，过60 目筛，85%乙醇回流提取3 次，料液比1 ∶8，每次2 h，合并提取液，过滤，减压蒸馏，浓缩，即得。然后，计算得率并配制成不同质量浓度药液，贮藏备用。

2.2 分组及给药 72 只小鼠随机分为空白组、模型组、联苯双酯滴丸组（150 mg／kg） 及杠板归乙醇 提 取 物 高、 中、 低 剂 量 组 （1.28、 0.64、0.32 g／kg）。除空白组外，其余各组小鼠均腹腔注射含1%CCl4橄榄油溶液（10 mL／kg） 造模，每3 d1 次。1 周后，各给药组按照10 mL／kg 剂量灌胃给予相应剂量药物，空白组、模型组灌胃给予等体积生理盐水，连续3 周，同时除空白组外，其余各组继续腹腔注射含1%CCl4橄榄油溶液。

2.3 血清AST、ALT 活性测定 末次给药后，小鼠禁食不禁水16 h，眼球取血，3 500 r／min 离心10 min，取上层血清，-20 ℃下保存，按照试剂盒标准，采用生化法检测AST、ALT 活性。

2.4 各组织中SOD 活性、MDA 水平测定 小鼠脱臼处死后，迅速解剖取肝脏、心脏、肾脏，冰生理盐水冲洗，滤纸吸干表面水分后称定质量，计算相关脏器指数，公式为脏器指数=脏器质量／体质量。在脏器固定位置取各组织约100 mg，洗净后按1 ∶9 比例加入冰生理盐水，冰水浴上制成10%组织匀浆，4 ℃、3 500 r／min 离心10 min，取上清，-20 ℃下保存备用。然后，考马斯亮蓝法进行蛋白定量，酶联免疫吸附（ELISA） 法检测SOD活性、MDA 水平。

2.5 组织病理学变化观察 将剩余小鼠肝脏、心脏、肾脏于10%福尔马林溶液中固定48 h，经过脱 水、 石 蜡 包 埋、 切 片、 脱 蜡、 苏 木 素-伊 红（HE） 染色等标准步骤后，制作常规HE 染色切片，光学显微镜下观察组织病理学变化。

2.6 统计学分析 通过SPSS 21.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，组间比较采用t 检验。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 杠板归乙醇提取物对脏器指数的影响 表1显示，与空白组比较，模型组脏器指数显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，除杠板归乙醇提取物高剂量组心脏指数外，各给药组脏器指数均有所降低，但无显著差异（P＞0.05）。

表1 杠板归乙醇提取物对脏器指数的影响（±s，n=12）Tab.1 Effects of ethanol extract of P．perfoliatum on viscera indices（±s，n=12）

表1 杠板归乙醇提取物对脏器指数的影响（±s，n=12）Tab.1 Effects of ethanol extract of P．perfoliatum on viscera indices（±s，n=12）

注：与空白组比较，∗∗P＜0.01

组别 肝脏指数 心脏指数 肾脏指数空模白型组组 34 89..48 38 88± ±39..56 36 75 ∗∗ 45..24 69 69± ±01..51 08 57 ∗∗ 11 15..80 80 42± ±12..92 37 6 1∗∗联苯双酯滴丸组 46.846±6.012 4.960±0.756 14.080±1.417杠板归乙醇提取物高剂量组 48.425±3.736 5.552±1.032 14.423±1.691杠板归乙醇提取物中剂量组 46.092±5.669 5.459±0.671 13.355±1.150杠板归乙醇提取物低剂量组 45.114±5.009 5.199±1.367 13.882±0.831

3.2 杠板归乙醇提取物对AST、ALT 活性的影响 表2 显示，与空白组比较，模型组AST、ALT活性显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，杠板归乙醇提取物组两者活性（除低剂量组AST 外） 显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

注：与空白组比较，∗∗P ＜0.01；与模型组比较，▲P ＜0.05，▲▲P＜0.01

3.3 杠板归乙醇提取物对各组织中SOD 活性、MDA 水平的影响 表3 ～4 显示，与空白组比较，模型组各组织中SOD 活性显著降低（P＜0.05，P＜0.01），MDA 水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，杠板归乙醇提取物高、中剂量组各组织中（除中剂量组心脏中外） 前者活性显著升高（P＜0.05），高剂量组各组织中、中剂量组肝脏中后者水平显著降低（P＜0.05）。

3.4 杠板归乙醇提取物对小鼠组织病变的影响

3.4.1 肝脏HE 染色 图1 显示，空白组小鼠肝小叶结构完整清晰，肝细胞索排列整齐，肝细胞形态正常，无细胞坏死等病变；模型组小鼠肝小叶结构模糊，肝细胞索紊乱，伴有炎性细胞浸润，细胞出现片状坏死；联苯双酯滴丸组、杠板归乙醇提取物组小鼠病变程度较轻，肝小叶结构基本完整，炎症细胞浸润改善，无片状细胞坏死。

表3 杠板归乙醇提取物对各组织中SOD 活性的影响（，n=12）Tab.3 Effects of ethanol extract of P．perfoliatum on SOD activity in various tissues（，n=12）

表3 杠板归乙醇提取物对各组织中SOD 活性的影响（，n=12）Tab.3 Effects of ethanol extract of P．perfoliatum on SOD activity in various tissues（，n=12）

注：与空白组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05

组别 肝脏／（U·mg prot-1） 心脏／（U·mg prot-1） 肾脏／（U·mg prot-1）空模联杠杠白型苯板板组组双归归 酯乙乙 滴醇醇丸提提组取取 物物 高中剂剂量量组组 21211 75087 56180.....39633 68546 40765±±±±±22712 55.84..6..30355 71126 5144▲ ∗▲▲ ∗ 21211 15087 47507.....84463 83022 84195±±±±±23223 44512.....61374 53342 78159 ∗▲▲∗ 21111 04788 33570.....64106 22615 25262±±±±±32213 18640.....56346 65805 24754∗▲▲▲杠板归乙醇提取物低剂量组 168.365±28.247 176.783±30.920 183.772±30.572

表4 杠板归乙醇提取物对各组织中MDA 水平的影响（，n=12）Tab.4 Effects of ethanol extract of P．perfoliatum on MDA level in various tissues（，n=12）

表4 杠板归乙醇提取物对各组织中MDA 水平的影响（，n=12）Tab.4 Effects of ethanol extract of P．perfoliatum on MDA level in various tissues（，n=12）

注：与空白组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 肝脏／（nmol·mg prot-1） 心脏／（nmol·mg prot-1） 肾脏／（nmol·mg prot-1）空模联杠杠白型苯板板组组双归归 酯乙乙 滴醇醇丸提提组取取 物物 高中剂剂量量组组 11 84891.....47946 74752 48125±±±±±72415.....88663 56791 84662 ∗▲▲▲ ▲ 14233 12801.....54161 07450 40323±±±±±41191.32.3 5..0.06481 52978 680▲∗▲∗▲ 11111 16334.....80293 70779 25024±±±±±34233.....85709 05602 13026∗▲▲杠板归乙醇提取物低剂量组 11.704±6.354 31.352±9.715 14.662±3.048

3.4.2 心脏HE 染色 图2 显示，空白组小鼠心肌细胞排列紧密，细胞核呈椭圆形，胞质呈均一状；模型组小鼠部分心肌细胞呈轻度肥大状，胞质局部淡染，间质内部分毛细血管充血和炎细胞浸润；联苯双酯滴丸组、杠板归乙醇提取物组小鼠心肌细胞肥大现象明显减轻。

3.4.3 肾脏HE 染色 图3 显示，空白组小鼠肾小球内皮细胞、足细胞、系膜细胞未见异常；模型组小鼠肾小球内毛细血管腔高度扩张，内皮细胞核呈固缩状，胞质空化，基底膜变薄，足细胞高度肿胀，胞质空化，足突细小或局部融合；联苯双酯滴丸组、杠板归乙醇提取物组小鼠肾小球结构均有不同程度的改善。

4 讨论

中医认为，心主血，肝藏血，肝为心之母，母病及子，故肝病可累及心，临床上肝病可及心，心病可及肝；肝藏血，肾藏精，精血同生，故肝阴和肾阴相互滋养，并且肝肾相生，均内藏相火，同时相火源于命门， 故肝和肾虚实密切相关， 相互制约。

图1 杠板归乙醇提取物对小鼠肝脏组织病理形态学的影响（×400）Fig.1 Effect of ethanol extract of P．perfoliatum on the pathomorphology of mouse liver tissues（×400）

图2 杠板归乙醇提取物对小鼠心脏组织病理形态学的影响（×400）Fig.2 Effect of ethanol extract of P．perfoliatum on the pathomorphology of mouse heart tissues（×400）

图3 杠板归乙醇提取物对小鼠肾脏组织病理形态学的影响（×400）Fig.3 Effect of ethanol extract of P．perfoliatum on the pathomorphology of mouse kidney tissues（×400）

化学性肝损伤是由化学肝毒物质所造成的肝损伤，而CCl4是公认的复制肝损伤动物模型的化学物质［5］，故本实验以其诱导小鼠亚急性肝损伤。结果，模型组与空白组之间各指标存在明显差异，可认为造模成功。

AST、ALT 均为非特异性细胞内功能酶，是临床上常用肝功能评价指标，正常情况下两者活性在血清中很低，而当肝细胞损伤时会发生变化，故其在一定范围内可反映生物体内肝细胞损伤程度［9］。本实验发现，杠板归乙醇提取物可明显降低AST、ALT 活性，表明它可改善肝细胞膜通透性和流动性，减少肝功能损伤。

SOD 能清除自由基以维持细胞不受自由基损害，其主要作用是降解清除体内的活性氧自由基，故检测其活性可反映清除自由基的能力及抗氧化能力［10］；MDA 作为脂质过氧化终产物，是反映组织损伤时出现过强氧化作用的指标之一，其活性越高，表明氧化活性越强，组织受损程度越大［11］。本实验发现，杠板归乙醇提取物能明显升高SOD、MDA 活性，表明它可有效维持组织抗氧化体系平衡状态，减轻CCl4引发组织氧化损伤。

另外，组织病理学发现杠板归乙醇提取物可明显减轻小鼠肝脏、心脏、肾脏细胞病理损伤，表明它在保护肝脏受损的同时对两者也有改善作用，但其关联机制还需进一步深入研究。