小丑鱼繁殖生物学研究进展

刘亚娟，胡 静，马振华

( 1.中国水产科学研究院 南海水产研究所，热带水产研究开发中心，海南 三亚 570218；2.农业部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300； 3.天津农学院，天津 300384 )

小丑鱼别称海葵鱼，属鲈形目、雀鲷科、海葵鱼亚科鱼类，传统形态学把该亚科分成双锯鱼属(Amphiprion)及棘颊雀鲷属(Premna)[1]。Allen[1]描述了已发现的双锯鱼属鱼类有27种，近年又发现了两个新物种[2-3]，迄今双锯鱼属有29种；全世界棘颊雀鲷属仅1种，海葵鱼亚科总计2属30种。

小丑鱼是一类具有较高观赏价值的热带珊瑚礁鱼类，其色彩美丽且性情温和，健壮活泼且易饲养。鉴于其特殊的雄性先熟的性反转现象、强领域性行为和独特的与海葵共生关系，过去30年里小丑鱼繁殖生物学始终是研究的热点，特别是在雄性先熟的性转化研究方面受到了极大的关注[4-14]。随着研究技术的不断改进，近年来有关性转化分子生物学方面的研究取得了一定的进展[15-18]。除此之外，小丑鱼繁殖生物学中包括繁殖季节、产卵量、求偶和产卵行为也取得了一定的突破。笔者从小丑鱼繁殖习性、性别分化、产卵与孵化3方面对小丑鱼的繁殖生物学研究进展进行剖析,以期为小丑鱼规模化养殖工作的开展提供启示，同时将丰富珊瑚礁鱼类的繁殖生物学研究，进而为珊瑚礁生态系统的保护工作提供科学依据。

1 繁殖习性

由于各海区条件不同，繁殖期也不同。关于小丑鱼的繁殖季节，研究者们已经分别对热带地区[4-5,7,10]、亚热带海区[10,19]和日本温带海区[8,9,20]的情况作了调查研究。在热带海区，小丑鱼呈现典型的非季节性产卵模式，产卵周期表现出较明显的月周期或半月周期特性[4,7]；温带地区的小丑鱼则存在短暂的产卵季节[21-22]；亚热带海区小丑鱼的产卵模式则介于两者之间[10]；温带和亚热带海区小丑鱼产卵高峰与海区水温同步，表现出比较弱的月规律性。虽然不同种类小丑鱼产卵高峰期是一致的，但同地区不同种类间以及同种类不同亲体间的产卵季节也存在较大差异，如澳大利亚东海岸的热带种类宽带双锯鱼(A.latezonatus)产卵只限于夏、秋季，而相同区域的本地特有种大堡礁双锯鱼(A.akindynos)则可以整年产卵[10]；同处于日本海域的克氏双锯鱼(A.clarkii)不同亲体产卵季节也有所不同[8,20-23]。

2 性别分化

2.1 性腺发育途径

小丑鱼是雌雄同体雄性先熟鱼类，即首先发育成雄性，经过一定的环境及种群演变，最后转化为雌性，与雌性先熟鱼类恰恰相反[24-25]。其性转化模式也为雀鲷科鱼类生活史中特有[6]。繁育过程中，领域内雌小丑鱼缺失时，雄性就不可逆地反转为雌性。另有研究表明，某些情况下幼鱼能够越过雄鱼阶段，直接变成雌鱼[26]。该现象一般发生在雌、雄鱼均离开鱼巢或幼鱼所到新巢穴中雄鱼和雌鱼均十分弱势的情况下。Hattori等[26]观察了日本海域克氏双锯鱼社会等级行为，发现雌鱼缺失后，雄鱼往往会寻找另一个宿主海葵中的雌鱼重新配对，原社群中的幼鱼或者未激活的雄鱼直接发育成雌鱼，并终身保有雌性功能。领域中已有配对且居主导地位时，其余小丑鱼会暂时处于无性别状态。甚至有些小丑鱼可能一生都是无性别状态，主要取决于其营养与环境。

2.2 性腺发育过程

综合组织学研究结果，小丑鱼性腺发育可以分为以下几个阶段[26-29]：(1)未成熟幼鱼性腺，初级卵母细胞卵巢占性腺的大部分，同时具有非功能性精巢组织；(2)亚成体腺，拥有一些功能性精囊和初级生长阶段的卵母细胞，没有可分辨的卵巢片层；(3)成熟雄鱼性腺为两性性腺，具备成熟的精巢 (内含不同发育阶段的精母细胞)及未成熟的卵巢(有卵原细胞卵囊及卵黄发生前期卵母细胞组织)；(4)性转化时期性腺，精巢组织退化，出现大量的游动精子，卵巢发育充满卵黄发生前期卵母细胞；(5)成熟前期雌鱼，具有卵巢腔和含卵片层，只有周边核仁期卵母细胞，没有精母细胞、精细胞或者精子；(6)成熟雌鱼，拥有卵巢及产卵片层，具有发育阶段不同的卵母细胞，而精巢缩小至很小的一条窄带，退化的组织包围着性腺。可根据有无卵黄期卵母细胞这一阶段又分为两个时期(Ⅰ和Ⅱ),雌性成熟Ⅱ期包含有卵黄形成期卵母细胞，而Ⅰ期中不含。

与其他双性鱼类性腺发育相比，小丑鱼性腺发育的主要特殊性为：性腺首先分化为卵巢，然后在卵巢中发育精巢，形成双性性腺；在双性性腺中，精巢和卵巢之间没有结缔组织薄膜隔开[28]，而其他双性鱼类性腺一般都有结缔组织薄膜隔开精巢和卵巢。

2.3 影响性腺发育的因素

影响小丑鱼亲鱼性腺发育的生态因素主要有水温[30]、溶解氧[31]、盐度[32]、营养[33-35]、人为干扰[36]等。营养是决定鱼类性腺发育的关键因素。人工养殖条件下，小丑鱼亲鱼性腺发育主要与饵料的营养状态有关。饵料种类及食饵量是性腺发育的物质基础，是卵子质量的决定因素[37]。小丑鱼体型较小，无法通过注射激素方法解决性腺发育问题，一般采用添加饵料促性腺发育物(如鱿鱼、深海鱼油、卵磷脂、VG-微生物滋养剂、维生素E等)来促进性腺发育。必需脂肪酸对亲鱼繁殖和仔鱼存活极为重要，亲鱼饵料中需要足量的高不饱和脂肪酸，才能保证获得较大的怀卵量。给小丑鱼投喂对虾、对虾+牡蛎、对虾+鱿鱼等饵料组合，发现新鲜虾肉加鱿鱼肉的组合能满足种鱼繁殖期间对饵料的要求[33]。而在克氏双锯鱼的促熟培养中，发现对虾+牡蛎混合投喂，亲鱼繁殖效果更好[38]。

温度是影响小丑鱼成熟和产卵的另一重要因素。小丑鱼的适宜繁殖水温在26～28 ℃，眼斑双锯鱼(A.ocellaris)在24～30 ℃[36]。低温(13～16 ℃)抑制小丑鱼的繁殖，温度降至24 ℃时，棘颊雀鲷(Premnasbiaculeatus)产卵间隔时间明显延长[37]，即使较小的温度波动，对其繁殖的影响也很大。换水时温差过大可导致鱼苗无法破膜而死亡[31]。不同的光照条件对亲鱼的性腺发育影响不同。鲍鹰等[37]在培育棘颊雀鲷亲鱼中发现，相同光周期下，水面光照度2000 lx与500 lx时受精卵的发育明显不同。低光照度下受精卵孵化时间延长，孵化率低。光照14 h+黑暗10 h下，小丑鱼性腺发育较好。亲鱼缸内无机盐(主要为磷酸盐和硝酸盐)含量过高时，藻类大量滋生，难以清洁，影响繁殖过程。繁殖环境中硝酸盐质量浓度应小于30 mg/L；亚硝酸盐氮应小于0.01 mg/L。人工养殖条件下，海葵和珊瑚并不是小丑鱼赖以生存和繁殖的必需条件，小丑鱼可以独立存活和繁衍，而海葵和珊瑚的存在可以增强其安全感，增加产卵次数[33]。应尽量减少环境因素对繁殖亲鱼的干扰，如人为走动等，也要避免不同的亲鱼产生保护领地的行为，带来环境的紧迫，而不利于其产卵[36]。

3 产卵与孵化

3.1 产卵行为

在产卵前几日，小丑鱼攻击行为更加剧烈，并为产卵场所做准备[4,39-41]。产卵期来临时，小丑鱼种鱼，尤其是雄鱼，在巢穴附近用嘴细啄仔细地清除岩石上的藻类和污物，用尾、胸鳍拂去砂砾用作未来的产卵床。性成熟时，雌鱼的输卵管及雄鱼的交配器显著突出。产卵日亲鱼食量明显减少，雌鱼腹部突出几毫米长的输卵管，并不时碰撞岩石摩擦自身腹部，随后产卵, 卵粒黏附在卵床上。雄鱼在卵粒上磨擦射精，雄雌鱼交替产卵、射精。受精卵孵化过程中，亲鱼用嘴清除坏卵，用腹鳍、胸鳍摆动扇动水流，卵四处摇摆，去除卵上污物，充分接触氧气。亲鱼护卵直至仔鱼孵出。其间大部分由雄鱼看护，雌鱼偶尔有看护行为[42]。

3.2 产卵间隔与时间

小丑鱼性成熟后，前几次产卵间隔较长且卵量较少，3～10次后，趋于稳定。白条双锯鱼(A.frenatus)[42]、眼斑双锯鱼[36]、棘颊雀鲷[33]在适宜的培养条件下，均能常年连续产卵。白条双锯鱼的正常产卵间隔为10～20 d，眼斑双锯鱼为9～13 d，棘颊雀鲷为9～15 d。若饵料不适合或摄食量较少时，产卵间隔延长到20 d。水质出现大幅度变化、移缸或鱼龄老化后，产卵间隔逾30 d[30]。白条双锯鱼[42]产卵高峰期是在9:00—11:00，棘颊雀鲷[33]一般约在11:00，眼斑双锯鱼[36]一般下午产卵。研究发现，如果把每日的光照时间提前，设定在4:00～6:00，亲鱼的产卵时间也会提前至7:00—9:00。这表明产卵时间与日出时间有关，产卵总是发生在日出后2～4 h[42]。

3.3 产卵次数与产卵量

小丑鱼单次产卵量与亲鱼个体、水质状况、饲料营养有很大关系。培育条件好, 水质稳定，则产卵量和孵化率高，反之则产卵量和孵化率低。正常情况下，眼斑双锯鱼、白条双锯鱼[42]和棘颊雀鲷每次分别产卵500～1000粒、800～1500粒和1500～2500粒[30]。在产卵季节，小丑鱼一般每月产卵1～2次。位于西太平洋马绍尔群岛的橙鳍双锯鱼(A.chrysopterus)、颈环双锯鱼(A.perideraion)和海葵双锯鱼(A.percula)平均每年产卵12～24次[4]；关岛的黑双锯鱼(A.melanopus)每年产卵24次[7]。亚热带海区的宽带双锯鱼每年产卵1～14次，平均8次；大堡礁双锯鱼每年产卵2～15次，平均6～7次[10]。而位于温带地区(如日本海区)的小丑鱼，每年产卵4～9次[9,21,43]。温带和亚热带海区产卵季节比较短，年产卵次数少。虽然热带海区小丑鱼产卵次数高于温带和亚热带地区，但目前还没有数据表明，热带海区小丑鱼年产卵量高于温带和亚热带海区。小丑鱼不仅有区域和种类差异，同区域同种类不同亲体之间的产卵次数和产卵量也存在较大差异。克氏双锯鱼雌鱼个体大小与年产卵次数呈负相关[9]。在水族箱中人工控制温度，几乎整年产卵，春秋季节产卵量增加。

3.4 受精卵的特征

小丑鱼卵呈长椭圆形的胶囊状结构，黏性，是典型的端黄卵，卵径约3 mm。白条双锯鱼[42]的受精卵(2.62 mm×0.96 mm)明显大于眼斑双锯鱼(1.8 mm×0.8 mm)、颈环双锯鱼(1.93 mm×0.8 mm)和克氏双锯鱼(2.14 mm×0.9 mm)，盘状卵裂，卵膜无色透明，在长轴即卵的动物极一端，有纤维状的附着丝，附着在产卵床上[4,39-41]。位于植物极一端的卵黄，内含一个大油球及多个大小不等的小油球。在良好的培养条件下，卵为鲜艳的橙色或橘红色，24 h后附着端发育为尾部，头部向外，随水流四处摇摆，接近孵化时出现银色的虹膜。孵化通常在日落后1.5 h至2 h，由雄鱼不断扇动卵块或人工微充气来完成[37]。

3.5 胚胎发育

目前有关黑双锯鱼[44]、鞍斑双锯鱼(A.polymnus)[45]、眼斑双锯鱼[46-47]、颈环双锯鱼[48]、海葵双锯鱼[49]、白条双锯鱼[42]、浅色双锯鱼(A.nigripes)[50]、背纹双锯鱼(A.akallopisos)[51]等的胚胎发育已有报道。小丑鱼胚胎发育的一般过程见表1。

表1 眼斑双锯鱼的胚胎发育[47]

3.6 孵化方式

产卵后，视鱼缸的大小、产卵地点、养殖模式、环境状况等，可选择亲鱼孵化或进行人工孵化。

3.6.1 亲鱼孵化

亲鱼单独养殖且鱼缸较小，循环系统独立可控，无敌害生物如水螅体等，温度光照可调的情况下应尽量选择亲鱼孵化。杂质和细菌污染会造成部分鱼卵死亡，亲鱼会清除这些死卵及杂质，避免其影响周围卵的发育。人工孵化难以完美模拟亲鱼扇动水流的频率与强度，所以亲鱼孵化的孵化率显著高于人工孵化[52]。亲鱼孵化时应选择在白天光照时观察胚胎发育，尽量避免在黑暗环境发育时光照观察。入夜后，大量幼鱼孵出，应派人留守。刚孵化的仔鱼体质较弱，微弱刺激就会被冲击而死，故接近孵出时关灯后应关闭循环系统数小时；若关灯后3～4 h仍无幼鱼孵出，说明当日幼鱼不会孵出，可恢复系统循环。初孵仔鱼有被亲鱼吞吃的危险，孵出后应与亲鱼分养。刚孵化的白条双锯鱼有趋光性，观察到孵出后，在背离卵的一侧水面进行光照，吸引孵出的小丑鱼，用吸管收集，转入其他容器饲养。

3.6.2 人工孵化

若附卵的礁石容易取出，光照和温度等条件可以满足时，可人工孵鱼。人工操作时模拟水流能力较差且未能及时取出坏卵，胚胎发育前期应采用亲鱼孵化。鱼眼的变化是受精卵发育程度的判断指标。孵出前1 d发育较好的胚胎眼睛呈亮银色，水流波动下可观察到明显的反光。当70%以上鱼眼呈亮银色反光时，即仔鱼将孵出。小丑鱼通常在“日落”后1 h内孵出，当天日落前将附卵的鱼巢带水取出，转入新鱼缸[37]。新鱼缸不可开启循环，应适当换水，控制水温、光照在合适的范围内。孵化缸也可采用亲鱼缸中的水，以便控制水质参数。在胚胎附近调节气石或气管阀门微量充气，模拟亲鱼胸鳍扇动水流作用，防止局部缺氧。充气不足胚胎会大批变白坏死；气泡太大，会伤害仔鱼。人工孵化时应避光孵化，即减少或避免鱼卵接触光照，使仔鱼尽可能在完全黑暗的条件下孵出。孵化持续约30 min，30～60 min后，微光下观察鱼卵的孵出情况[36]。仔鱼孵出后，可直接用孵化缸饲养，避免人为转移的机械损伤。孵化完毕时幼鱼卵黄已所剩无几，可去除遮光物，添加小球藻和小球藻强化的轮虫，轮虫的密度为10个/L。

4 小 结

目前对小丑鱼性别分化机制已进行了广泛的研究，近年又运用了超微结构分析结合分子生物学方法，试图从解剖学、内分泌学和行为生态学等多角度阐明小丑鱼性别分化的机理，但尚有许多问题，如在性别分化过程中精巢如何退化，卵巢如何被激发，哪种特定激素在卵巢分化和精巢组织在卵巢中分化中起关键作用，这些激素又如何被触发等等，有待于进一步研究。但是，温度影响小丑鱼繁殖周期及其胚胎发育的时间。大量的观测数据和研究表明，到本世纪末，地球气温预测将升高2～4 ℃，海水温度也将上升约70% (约1～3 ℃)[53-54]。珊瑚礁鱼类的早期生活阶段对温度变化尤为敏感，温度升高的范围超过其最适温度，将会影响仔鱼成活率、游泳能力、生长速率及呼吸速率等[54-55]。珊瑚礁鱼类成鱼对水温的变化也很敏感，特别是性腺成熟和产卵，对水温的要求范围很窄。因此，笔者认为有必要针对温度的升高对小丑鱼早期生活阶段仔稚鱼的生长和发育及亲鱼的繁殖周期和产卵行为的影响开展相关的研究工作。