拟诺卡氏菌骨架对凡纳滨对虾生长及免疫功能的影响

吴佩佩，孟 阳，毕建才，崔青曼，袁春营

( 天津科技大学 海洋与环境学院，天津市海洋环境保护与修复技术工程中心，天津市海洋资源与化学重点试验室，天津 300457 )

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)，又称南美白对虾，原产于美洲太平洋沿岸水域，主要分布在秘鲁北部至墨西哥湾沿岸，以厄瓜多尔沿岸分布最为集中，中国科学院海洋研究所于1988年自美国夏威夷引进中国，现已在全国广泛养殖。但随着养殖时间的推移，对虾品种明显退化，对病害的抵抗力降低，加上养殖环境的恶化，致使病害频发，严重制约我国对虾养殖业的健康发展。

由于抗生素之类的药物已受到严格控制，所以国内外学者和养殖户把目光聚焦在免疫增强剂上，希望通过提高养殖对虾机体的免疫力，增强其抵抗病害和应激的能力，提升对虾养殖成功率和养殖水平[1-6]。

拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)为一类经典的丝状放线菌群，其基丝异常发达，能够断裂成杆状或球状，气丝发育良好，多为长或短的分枝，Meyer[7]最早对于该类菌进行过描述，截止到2015年12月，拟诺卡氏菌属已公开发表的新种为42个、亚种为2个[8]。拟诺卡氏菌属细胞壁组分Ⅲ型，主要由肽聚糖组成。笔者自凡纳滨对虾养殖池底泥中分离出1株拟诺卡氏菌，经过16S rDNA同源序列分析，确定为卢森坦拟诺卡氏菌(N.lucentensis)，将该菌株制备的细胞壁骨架制剂应用于凡纳滨对虾养殖，探讨其对对虾生长及免疫功能的影响，以期为凡纳滨对虾新型免疫增强剂的开发开辟一条新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 拟诺卡氏菌细胞壁骨架

本试验室分离纯化的卢森坦拟诺卡氏菌发酵液，经过超声波破碎、离心、胰蛋白酶酶解、脱脂、冷冻干燥，得到白色细胞壁骨架。

1.1.2 凡纳滨对虾

试验用凡纳滨对虾购自天津鑫永丰水产养殖有限公司，体长(6.86±1.32) cm，体质量(4.21±1.28) g。

1.1.3 试验用试剂盒

所有试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.4 试验饲料

试验饲料为自行配制，基础配方见表1。饲料原料经粉碎后过80目筛，各原料按配比定量后混合均匀，然后加入适量的水揉匀，经双螺杆挤条机挤压出直径为1.0 mm的饲料，60 ℃烘干后剪切成1.5 mm长的颗粒贮存备用。

表1 饲料基础配方 %

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

试验设置2个细胞壁骨架组，添加量分别为0.1%和0.2%，1个对照组，每组设3个平行，共计9个处理组。水族箱规格720 mm×490 mm×380 mm，每个水族箱中投放对虾30尾。

1.2.2 饲养管理

饲养试验持续4周，投饵量按照对虾体质量的4%～6%进行投喂，日投喂4次(6:00、11:00、16:00和21:00)，各时间点投喂量占日总投饵量的比值分别为30%、20%、30%和20%。饲养期间连续充气，水温27～29 ℃，盐度18～20，pH 7.8～8.1，溶解氧>6 mg/L。

1.2.3 对虾样品的采集与指标测定

1.2.3.1 生长指标

4周养殖试验结束，分别对每个处理组对虾进行计数，称量质量，计算对虾的存活率及特定生长率：

存活率/%=nt/n0×100%

特定生长率/%·d-1=(lnmt-lnm0)/t×100%

式中，n0和nt分别为每个重复对虾初始尾数和终末尾数，m0和mt分别为初始体质量和终末体质量，t为试验时间。

1.2.3.2 抗凝血的制备

用1 mL的无菌注射器，按照血淋巴与抗凝剂为1∶2的比例，由每个重复中随机取出10～12尾虾，从腹窦部位进行取血。所取抗凝血，一部分直接用于呼吸爆发活性的测定，另一部分离心10 min(3000 r/min，4 ℃)，所得的上清液一部分用于血清酚氧化酶活力的测定，另一部分放于-70 ℃超低温冰箱中保存，用于其他指标的测定。

1.2.3.3 肝胰腺组织匀浆的制备

将抽取血液后的对虾解剖，取出肝胰腺，置于5 mL离心管中，将肝胰腺置于冰水浴中，加入9倍体积0.05 mol/L、 pH 6.5的磷酸盐缓冲液放入组织匀浆器中进行匀浆，匀浆液经3000 r/min离心15 min，上清液即为10%肝胰腺组织匀浆，取匀浆液少许，按照南京建成试剂盒说明书，测定匀浆液中可溶性蛋白质含量，其余的4 ℃保存，用于后续指标测定。

1.2.3.4 超氧化物歧化酶的活性

南京建成试剂盒测定超氧化物歧化酶的活性。血清中超氧化物歧化酶活力单位定义：每毫升反应液中超氧化物歧化酶抑制率达到50%时所对应的超氧化物歧化酶量为1个超氧化物歧化酶活力单位(U)；肝胰腺中超氧化物歧化酶活力单位定义：每毫克蛋白质中超氧化物歧化酶抑制率达到50%时所对应的超氧化物歧化酶量为1个超氧化物歧化酶活力单位(U)。

1.2.3.5 一氧化氮合酶活性

南京建成试剂盒测定一氧化氮合酶活性。血清中一氧化氮合酶活力单位定义：每毫升血清每分钟生成1 nmol一氧化氮为1个酶活力单位(U)；肝胰腺中一氧化氮合酶活力单位定义：每毫克组织蛋白质每分钟生成1 nmol一氧化氮为1个酶活力单位(U)。

1.2.3.6 丙二醛活性

南京建成试剂盒测定丙二醛的浓度。测定原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛可与硫化巴比妥酸缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰，由此测定丙二醛的浓度。

1.2.3.7 酚氧化酶活性

参照南京建成虾酚氧化酶酶联免疫检测试剂盒说明书进行。应用双抗体夹心法测定样品中对虾酚氧化酶水平，标准曲线计算样品中对虾酚氧化酶的活性。

1.2.3.8 溶菌酶活性

南京建成试剂盒测定溶菌酶活性。测定原理：在一定密度的混浊菌液中，由于溶菌酶能水解细菌细胞壁上的肽聚糖使细菌裂解，体系密度降低，透光度增强，根据透光度变化推测溶菌酶活性(1 μg=80 U)。

1.2.3.9 谷胱甘肽过氧化物酶活性

南京建成试剂盒测定谷胱甘肽过氧化物酶活性。血清中谷胱甘肽过氧化物酶活力单位定义：每0.1 mL血清在37 ℃反应5 min，扣除非酶促反应作用，使反应体系中谷胱甘肽浓度降低1 μmol/L为1个酶活力单位(U)；肝胰腺中谷胱甘肽过氧化物酶活力单位定义：每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶促反应的作用，使反应体系中谷胱甘肽浓度降低1 μmol/L为一个酶活力单位(U)。

1.2.3.10 呼吸爆发活性

参考文献[9]的方法略有改动。取100 μL抗凝血，加入100 μL(1 μg/mL)佛波醇—肉豆蔻酸—乙酯，37 ℃温育30 min，然后加入100 μL 0.3%氯化硝基四氮唑蓝，37 ℃温育30 min，5000 r/min，4 ℃，离心10 min，去除上清液，加入200 μL纯甲醇终止反应，10 min后，5000 r/min，4 ℃，离心10 min，去除上清液，然后用70%甲醇反复洗涤3次，最后一次离心去除上清液后，于室温下晾干，经干燥后，加入120 μL 12 mol/L KOH和140 μL二甲基亚砜，充分溶解，在酶标仪上测定630 nm处的吸光值(OD630)。呼吸爆发活性表示为OD630。

1.2.4 攻毒试验

投喂28 d后，对3个试验组剩下的对虾各取11尾进行攻毒，第3腹节肌肉注射副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)菌悬液(1.2×108cfu/mL) 0.1 mL，对照组中注射相同剂量的生理盐水，记录接种7 d后各组对虾的累积死亡率。

1.2.5 数据处理与分析

各处理组数据进行单因素方差分析。以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 细胞壁骨架对凡纳滨对虾生长及存活率的影响

试验结束后，统计各处理组对虾死亡尾数，测定各存活对虾体质量，计算存活率和特定生长率，结果见图1、图2。添加0.1%骨架制剂的凡纳滨对虾的特定生长率和存活率最高，极显著高于对照组(P<0.01)，0.2%骨架制剂添加组对虾的特定生长率和存活率极显著高于对照组(P<0.01)。由此可见，饲料中添加拟诺卡氏菌细胞壁骨架制剂，能够显著提高凡纳滨对虾的生长和成活率，且以0.1%的添加最适宜。

图1 不同处理组凡纳滨对虾的特定生长率比较*>*表示与对照组相比，差异极显著(P<0.01).下同.

图2 不同处理组凡纳滨对虾的存活率比较

2.2 细胞壁骨架对凡纳滨对虾超氧化物歧化酶活性的影响

对不同处理组的对虾进行了血清和肝胰腺中超氧化物歧化酶活性的分析比较，结果见表2。拟诺卡氏菌细胞壁骨架均能极显著提高凡纳滨对虾肝胰腺中超氧化物歧化酶的活性(P<0.01)，添加0.1%的拟诺卡氏菌细胞壁骨架，能显著提高凡纳滨对虾血清中超氧化物歧化酶的活性(P<0.05)。

表2 不同处理组凡纳滨对虾超氧化物歧化酶活性比较

注：*表示与对照组相比，差异显著(P<0.05)；*>*表示与对照组相比，差异极显著(P<0.01).下同.

2.3 细胞壁骨架对凡纳滨对虾一氧化氮合酶活性的影响

一氧化氮既可通过杀伤、抑制病原体发挥抗感染的作用，同时也参与对宿主免疫病理的调节，一氧化氮的合成有赖于一氧化氮合酶的催化作用。不同处理组凡纳滨对虾一氧化氮合酶活性测定结果表明，拟诺卡氏菌细胞壁骨架制剂均能显著提高凡纳滨对虾血清及肝胰腺组织中的一氧化氮合酶活性(P<0.05，P<0.01)(表3)。

表3 不同处理组凡纳滨对虾一氧化氮合酶活性比较

2.4 细胞壁骨架对凡纳滨对虾丙二醛的影响

生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛，其会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。不同处理组凡纳滨对虾丙二醛测定结果表明，拟诺卡氏菌细胞壁骨架制剂的添加均能极显著降低凡纳滨对虾血清及肝胰腺组织中的丙二醛浓度(P<0.01)(表4)。

表4 不同处理组凡纳滨对虾丙二醛浓度的比较

2.5 细胞壁骨架对凡纳滨对虾酚氧化酶活性的影响

不同处理组凡纳滨对虾酚氧化酶活性的测定结果见表5，饲料中添加0.1%拟诺卡氏菌细胞壁骨架，能够显著提高凡纳滨对虾血清和肝胰腺组织中的酚氧化酶活性(P<0.05，P<0.01)，添加0.2%拟诺卡氏菌细胞壁骨架，虽然也能显著提高对虾血清和肝胰腺组织中的酚氧化酶活性(P<0.05)，但作用程度弱于0.1%拟诺卡氏菌细胞壁骨架添加组。

表5 不同处理组凡纳滨对虾酚氧化酶活性的比较

2.6 细胞壁骨架对凡纳滨对虾溶菌酶活性的影响

饲料中添加0.1%拟诺卡氏菌细胞壁骨架，能够显著提高凡纳滨对虾血清和肝胰腺组织中的溶菌酶活性(P<0.05，P<0.01)，添加0.2%拟诺卡氏菌细胞壁骨架，能够极显著提高对虾血清中的溶菌酶活性(P<0.01)，明显提高对虾肝胰腺组织中溶菌酶

活性，但未达显著性差异水平(P>0.05)(表6)。

表6 不同处理组凡纳滨对虾溶菌酶活性的比较

2.7 细胞壁骨架对凡纳滨对虾谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响

不同处理组凡纳滨对虾谷胱甘肽过氧化物酶活性的测定结果见表7。饲料中添加0.1%和0.2%拟诺卡氏菌细胞壁骨架，均能够显著提高凡纳滨对虾血清和肝胰腺组织中的谷胱甘肽过氧化物酶活性(P<0.05，P<0.01)。

表7 不同处理组凡纳滨对虾谷胱甘肽过氧化物酶活性的比较

2.8 细胞壁骨架对凡纳滨对虾血液呼吸爆发活性的影响

饲料中添加0.1%拟诺卡氏菌细胞壁骨架，能够极显著提高凡纳滨对虾血淋巴中的呼吸爆发活性(P<0.01)，添加0.2%拟诺卡氏菌细胞壁骨架，能显著提高对虾血淋巴中呼吸爆发活性(P<0.05)(表8)。

表8 不同处理组凡纳滨对虾呼吸爆发活性的比较

2.9 细胞壁骨架对凡纳滨对虾攻毒死亡率的影响

对于各处理组剩余的凡纳滨对虾，各取11尾进行副溶血弧菌攻毒试验，统计死亡率，结果见图3，与对照组比较，对虾饲料中添加细胞壁骨架后，对虾死亡率明显降低，0.1%添加组的死亡率为54.55%，0.2%添加组的死亡率为63.64%，而对照组的死亡率高达81.82%，由此可见，细胞壁骨架可以明显提高凡纳滨对虾的机体免疫力，从而降低攻毒死亡率。

图3 副溶血弧菌攻毒后不同处理组凡纳滨对虾死亡率的比较

3 讨 论

3.1 细胞壁骨架对凡纳滨对虾酚氧化酶活性的影响

β-葡聚糖、肽聚糖和免疫多糖等，具有提高虾类免疫功能的作用[10-13]。甲壳动物具有脂多糖受体蛋白、葡聚糖受体蛋白等多种受体结合蛋白，这些受体蛋白能够识别并结合特定的免疫多糖，诱发机体的酚氧化酶原激活系统，进而产生酚氧化酶，在氧分子存在下，该酶能把酚类氧化成成醌，醌类可抑制微生物的感染；同时，免疫多糖还可以刺激颗粒细胞脱颗粒释放出免疫活性物质，增强血细胞的吞噬活性，提高消灭病原体的能力[14]。刘小玲等[15]通过研究桦褐孔菌多糖对凡纳滨对虾生长和血清免疫相关酶活性的影响，发现桦褐孔菌多糖能够显著促进凡纳滨对虾幼虾的生长，增强对虾血清溶菌酶、碱性磷酸酶活性和总抗氧化能力，降低血清丙二醛含量；饲料中添加美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamselae)，也能够提升凡纳滨对虾非特异性免疫水平，增强抵抗疾病的能力[16]。本试验研究发现，对虾饲料中添加拟诺卡氏菌细胞壁骨架，可能诱发了对虾机体的酚氧化酶原激活系统，从而显著增强了凡纳滨对虾酚氧化酶的活性，抑制了副溶血弧菌的感染，降低了攻毒后的死亡率。

3.2 细胞壁骨架对凡纳滨对虾生化活性的影响

超氧化物歧化酶是一种源于生命体的活性物质，是生物体内重要的抗氧化酶；一氧化氮合酶催化生成的一氧化氮既可以通过杀伤、抑制病原体发挥抗感染的作用，又可以参与对宿主免疫病理的调节[17]；丙二醛浓度的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度；溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁中的不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，致使细胞壁破裂，内容物逸出，细菌溶解；谷胱甘肽过氧化物酶是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，能催化谷胱甘肽变为氧化型谷胱甘肽，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害；呼吸爆发是氧依赖性吞噬细胞杀菌途径之一，常常作为衡量吞噬细胞活力的重要指标之一。本研究中采用超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、丙二醛、溶菌酶、谷胱甘肽过氧化物酶和血液呼吸爆发活性作为凡纳滨对虾的免疫学指标，研究了拟诺卡氏菌细胞壁骨架对这些免疫学指标的影响，结果发现，0.1%含量的拟诺卡氏菌细胞壁骨架制剂显著提高除丙二醛浓度外的凡纳滨对虾系列免疫指标的活性，显著降低丙二醛浓度，从而提高了对虾的机体免疫力和养殖成活率，同时发现，增加骨架制剂的使用量，并未增强对虾免疫指标的活性，反而有所降低，分析原因，可能是产生了免疫疲劳。总之，适量的细胞壁骨架制剂有望作为一种新型对虾免疫增强剂被进一步开发利用。