间充质干细胞治疗糖尿病肾病的研究进展

张洁 汪姣 江妍霞 徐积兄

南昌大学第一附属医院内分泌科 330006

糖尿病肾病(DN)已成为发达及发展中国家导致终末期肾病(ESRD)的主要原因。DN的发病与遗传易感性、血液动力学改变、晚期糖基化终末产物的形成、炎性细胞因子的分泌及氧化应激等因素有关[1]。病理上主要表现为结节性肾小球硬化、系膜扩张、肾小管间质纤维化、内皮细胞损伤及足细胞减少[2]。早期DN主要表现为微量白蛋白尿，随着病变进展，尿白蛋白排泄率持续升高，出现大量白蛋白尿，最终可能发展至尿毒症期[3]。目前DN的治疗主要是通过控制血糖、血压、血脂及抑制肾素-血管紧张素系统等，但这些措施并不能阻止DN向ESRD进展。近年来，随着再生医学技术的发展，干细胞治疗为DN带来了新的希望。间充质干细胞(MSCs)具有来源广、易获取及避免胚胎干细胞伦理相关问题等优势，已成为近年治疗糖尿病及其并发症的研究热点。

1 MSCs概述

MSCs是一种多功能干细胞，可以来自骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带、皮肤、羊水和胎盘等多种不同的器官或组织。MSCs具有多向分化潜能，能分化为成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞，在一定条件下，亦能分化为心肌细胞、星形胶质细胞、肝细胞等，并且，MSCs还具有旁分泌血管生成因子、细胞因子和免疫调节物质的能力[4]。目前用于治疗DN的MSCs有骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)、脂肪间充质干细胞(ADMSCs)及脐带间充质干细胞(UCMSCs)。不同来源的MSCs特性不同，如BM-MSCs具有易于体外扩增、可塑性高的特点[5]。ADMSCs具有易获取、易于体外扩增及稳定性高的特点，与BM-MSCs相比有更强的免疫调节作用，可表达更高水平的细胞因子[4，6]。而UCMSCs具有无创收集、污染性小、抑制肿瘤生长和低免疫原性等优点[7]。目前在动物及临床研究中，应用MSCs治疗DN都取得了一定的成功。

2 MSCs治疗DN的可能机制

2.1 调节炎性反应及免疫反应 免疫介导的炎性反应是导致DN患者肾脏纤维化和结构重塑的关键，树突状细胞(DC)、巨噬细胞、T淋巴细胞等多种免疫细胞都参与其中[8]。研究发现，MSCs能通过多种方式参与免疫调节：(1)调节巨噬细胞的极化状态。巨噬细胞能分泌大量促炎性细胞因子及趋化因子，研究发现，MSCs可调节巨噬细胞从炎性M1表型向抗炎M2表型的转化，可能与MSCs旁分泌的细胞因子、蛋白酶、趋化因子以及免疫调节剂(如长五肽3)等多种因子有关。此外，MSCs也能直接诱导巨噬细胞产生抗炎细胞因子[9]。(2)抑制DC的成熟。研究发现，MSCs可下调DC表面CD80、CD86、CD40、OX40L的表达，调节DC中信号转导与转录激活因子(STAT)1/STAT 6磷酸化，从而抑制DC的成熟[10]。(3)调节T细胞亚群的存活、激活和分化。MSCs可通过抑制细胞周期蛋白D2的表达，以及CD4+和CD8+T细胞的增殖，介导T细胞免疫抑制。其中MSCs对CD4+T细胞亚群表现出不同的免疫调节作用：首先，MSCs可通过前列腺素E2(PGE2)依赖性方式以及上调程序性死亡受体1(PD1)的表达，分别抑制促炎性辅助性T细胞1(Th1)细胞因子的产生和辅助性T细胞17(Th17)分化。其次，MSCs可通过多种细胞因子来介导抗炎性调节性T细胞的分化[11]。(4)MSCs通过减少活性氧簇的产生发挥免疫调节作用。循环高葡萄糖环境导致机体产生过多的活性氧簇，随着氧化产物增多可激活核因子-κB，核因子-κB通路被激活后可触发促炎分子的产生，促进炎性反应[3, 12]。研究发现，UCMSCs外小体可通过提高细胞活力和降低氧化产物水平，部分逆转活性氧簇对细胞的损伤[13]。此外，MSCs也可通过降低血糖来减少活性氧簇的产生[14-15]。然而也有研究提示，干细胞治疗对血糖水平无明显影响。上述不同研究结果可能与MSCs的培养条件、给药途径和剂量等多种因素有关。总之，MSCs可通过调节炎性反应及免疫，减少肾组织损伤。

2.2 通过旁分泌或内分泌作用促进受损肾脏的修复 基于MSCs的多项分化潜能，其肾脏修复作用过去主要被认为因为归巢至受损肾组织，分化为肾固有细胞。但近年的研究显示，糖尿病小鼠经荧光标记的MSCs治疗后，肾脏中只检测到少量的MSCs，提示MSCs的旁分泌作用可能是减轻肾脏损伤的主要机制[16]。MSCs可分泌多种营养保护因子及释放细胞外囊泡(EVS)，从而减少肾固有细胞凋亡，减少氧化应激、炎性反应及肾纤维化，以及调节肾血管生成来促进肾脏修复。

MSCs治疗DN的主要作用机制是旁分泌营养因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)等[15, 17-22](表1)。

表1 MSCs旁分泌的营养因子

2.2.1 HGF HGF具有抑制炎性反应与纤维化的作用。研究发现，HGF可通过减少单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达来减少巨噬细胞浸润，从而减少促炎细胞因子的表达[23]。并且，HGF可抑制转化生长因子-β在肾小球系膜细胞的表达[18]。转化生长因子-β上调可引起细胞外基质(ECM)积累，导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化[3, 24]。此外，HGF还可下调葡萄糖转运蛋白1的膜定位，减少高血糖刺激的氧化物的产生，从而减少肾脏损伤[18]。

2.2.2 BMP-7 BMP-7是转化生长因子-β超家族的重要成员，可通过改善肾纤维化、减少足细胞损伤参与肾脏修复。研究发现，BMP-7可拮抗转化生长因子-β/Smad信号依赖性纤维化[19, 25]。并且，BMP-7可通过激活Smad 1/5/8的磷酸化，减少足细胞凋亡，从而维持肾脏正常滤过作用[21]。

2.2.3 MMP-9 MMP-9是参与ECM代谢的重要酶类，ECM积聚是导致肾脏纤维化的最终途径。研究发现，MMP-9对肾脏纤维化的抑制作用可能与影响转化生长因子-β/Smad信号通路有关[15]。

2.2.4 其他 EGF可抑制高糖诱导的足细胞凋亡和损伤，明显改善足细胞表达的突触素和nephrin蛋白的减少和紊乱[20]。VEGF对维持肾小管周围毛细血管完整性起重要作用[22]。IGF-1可促进近端肾小管细胞增殖，促进组织再生[17]。因此，MSCs旁分泌对肾功能的改善起重要作用。

MSCs不仅可分泌上述可溶性保护因子促进内源性修复，其释放的EVS介导的遗传信息传递也有重要作用。EVS主要包括外小体及微囊泡。外小体产生于细胞内小体，而微囊泡起源于细胞膜的外芽，二者均携带大量蛋白质及遗传物质[26-27]。EVS不仅直接参与调节细胞的生物活性，并且在靶细胞中充当细胞应激信号，发挥与MSCs相似的生物活性，在多种肾脏疾病模型中，如缺血-再灌注肾损伤、药物性肾病、肾血管性疾病、单侧输尿管梗阻导致的肾病等，均观察到了EVS的治疗效果[26]。

2.3 具有多项分化潜能，归巢及分化为肾固有细胞或与其融合，参与肾脏修复 MSCs具有对组合信号反应并迁移到受损组织中的能力，这一过程被称为归巢[28]。研究发现，DN受损肾组织局部基质细胞衍生因子-1(SDF-1)表达水平明显升高，可通过SDF-1/CXCR 4轴促进MSCs归巢至肾脏，促进肾脏的修复[29]。

MSCs归巢至受损肾组织后，可分化为肾固有细胞或与其融合修复肾脏。(1)肾固有细胞的分化：研究发现，ADMSCs可通过激活素A、低浓度维甲酸与BMP-7的联合作用分化为足细胞样细胞，将其移植到阿霉素处理的小鼠体内可明显改善其白蛋白尿和肾损伤[30]。此外，将MSCs与经过氧化氢损伤的系膜细胞共培养，发现MSCs可出现系膜细胞样形态的变化[31]。(2)与肾固有细胞融合：细胞融合是指两个或多个相同或不同类型的细胞在组织生长和再生过程中结合在一起，表现出混合基因型和表型[32]。既往研究发现，MSCs可以与心肌细胞融合，改善心功能，亦能与胰岛细胞融合，维持β细胞的功能[33-34]。同样，MSCs与肾脏的固有细胞融合是否也可以恢复肾功能？近年研究发现，将荧光标记EVS注射入急性肾损伤大鼠体内后，EVS与肾小管上皮细胞融合，并促进血管生成，考虑与EVS直接将VEGF蛋白传递到肾小管上皮细胞有关[22]。目前关于MSCs在不同肾脏疾病模型中的研究尚有争议，需要进一步研究及改善现有的跟踪可视化技术，从而观察MSCs在体内与受损的肾固有细胞之间的“交流”。

3 MSCs治疗DN的动物研究

近年研究发现，MSCs治疗可明显改善肾脏指数及形态学异常(表2)，如降低尿白蛋白排泄量、血清尿素、肌酐和尿酸水平，并且，肾小球、肾小管、肾间质病理改变明显缓解[14-16]。 Nagaishi等[16]研究发现，MSCs培养基与MSCs表现出相似的特性，可抑制骨髓源性细胞的过度浸润及炎性因子的表达，减少肾小管的损伤。将纯化的外小体注入糖尿病大鼠单侧肾包膜下后，发现外小体可抑制肾细胞凋亡和变性。表明MSCs的治疗作用可能主要是通过EVS和营养因子的释放来实现的。

表2 MSCs治疗DN的动物研究

4 MSCs治疗DN的临床研究

近年国内、外研究者已逐渐开展临床试验，研究基于MSCs干预措施的安全性、可行性和耐受性，以及对DN患者的疗效。目前有两项临床试验已完成，Packham等[36]将异基因间充质前体细胞输注于20例成人DN患者体内，并与10例安慰剂组患者进行对照，输注过程耐受性好，未观察到异基因细胞治疗的理论风险，然而对于肾功能的改善作用尚无明确结论。赵堂亮等[37]将UCMSCs移植到15例DN患者体内，与15例单纯口服缬沙坦、皮下注射胰岛素治疗的DN患者作对照，结果发现，UCMSCs移植安全有效，在改善舒张压、肾功能方面的临床疗效优于单纯控制血压、血糖等常规方法。表明MSCs治疗DN已经在临床试验中取得了一定的成功。

综上所述，MSCs在治疗DN中具有广阔的应用前景，然而还有很多问题有待解决，如MSCs的注射部位、给药途径、最佳细胞治疗剂量与疗程等。当然，干细胞作为一种临床治疗手段，也要评估其可能存在的风险，肾脏由不同功能的细胞组成，干细胞分化成肾单位取代受损肾单位十分困难，所以在选择干细胞时，除了考虑其分化增殖潜能外，更需考虑其细胞功能。通过免疫调节和旁分泌的作用，上调抗炎因子和下调促炎因子的产生，可减轻肾脏疾病炎性反应的发生，改善肾功能。目前仍需要大量开展临床试验，从而综合评估其有效性、可行性及可能存在的风险。总之，干细胞移植为DN提供了新的治疗策略，但如何达到临床所期望的效果，有待进一步研究探索。