神经调节蛋白-1在高糖诱导的视网膜Müller细胞凋亡中的作用

李宏淼 马连学 曾瑞霞 单伟

1锦州医科大学基础医学院解剖学教研室 121001; 2辽宁省健康产业集团抚矿总医院(中国医科大学第七临床学院)检验科，抚顺 113008

Müller细胞为视网膜胶质细胞，在糖尿病状态下，过度活化的Müller细胞会导致神经损伤，引起血管生成因子增加，产生新生血管，进而导致慢性炎性视网膜环境，最终导致细胞死亡[1-3]。神经调节蛋白-1(NRG-1)为一类具有神经保护作用的细胞间信号转导蛋白，对神经元的生长、存活具有重要作用[4]。研究发现，应用NRG-1治疗局灶性脑缺血大鼠模型，可发挥强大的神经保护作用，有效减少神经元死亡数目[5]。尽早使用外源性NRG-1，可有效防止视神经损伤大鼠模型中神经元损伤，对于损伤后神经再生、神经功能的恢复大有益处[6]。但NRG-1对糖尿病状态下Müller细胞损伤的影响尚不清楚。因此，本研究以高浓度葡萄糖培养Müller细胞，探讨NRG-1对高葡萄糖对Müller细胞的影响及机制，为寻找糖尿病视网膜损伤的治疗方案拓展思路。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 Müller细胞株购自上海钰博公司。

1.2 主要试剂和仪器 胎牛血清、DMEM高糖培养基购自Hyclone生物科技有限公司；BCA 试剂盒、Annexin V-FITC凋亡试剂盒、噻唑蓝法(MTT)试剂盒、JC-1试剂盒、丙二醛含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性试剂盒均购自碧云天公司；Bcl-2、Bax、β-actin抗体购自美国Abcam公司；流式细胞仪购自美国BD公司；CO2细胞培养箱购自美国SIM公司；荧光倒置显微镜购自日本OLYMPUS。

1.3 细胞培养及分组 将Müller细胞株置于37℃、5% CO2孵箱中培养(DMEM培养基+10%胎牛血清)，当细胞覆盖瓶底达80%左右时传代。24 h后给予不同处理因素，对各处理因素的剂量均进行浓度梯度预实验，根据最适浓度进行分组培养，分为对照组(空白对照)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、NRG-1处理组(30 mmol/L葡萄糖+80 mg/L NRG-1)，3组均给与DMEM培养基+10%胎牛血清，并于培养的第3 天检测指标。

1.4 MTT检测Müller细胞活力 调整Müller细胞悬液为1×104/200 μl，置于96孔板中培养，24 h细胞贴壁后分组处理，在培养第3 天时再换100 μl无血清培养基，培养3 h后加入5 g/L MTT溶液20 μl，3 h后弃溶液，加DMSO并振荡，使蓝色结晶物完全溶解。利用酶标仪检测490 nm波长处光吸收值(A值)，按如下公式计算细胞活力：细胞活力=实验组A值/对照组A值×100%。

1.5 试剂盒检测Müller细胞丙二醛含量及SOD活性 用4℃生理盐水制备5%Müller细胞匀浆，5 000 r/min(r=10 cm)离心30 min，取上清；按试剂盒操作得到OD值，根据OD值分别计算Müller细胞的丙二醛含量及SOD活性。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率 将各组细胞处理为单细胞悬液，以2×106个/ml接种6孔板中，培养48 h后常规消化，5 000 r/min(r=10 cm)离心10 min，弃上清，收集细胞，PBS洗2次，按Annexin V-FITC说明书操作测定细胞凋亡率。

1.7 Western印迹检测Müller细胞Bcl-2、Bax蛋白表达 提取细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度，蛋白上样量为40 μg加入15 μl样品缓冲液。10% SDS-PAGE凝胶电泳，后转移至PVDF膜，以含1% BSA的TBST室温封闭2 h；加入一抗4℃孵育过夜；TBST洗涤4次，每次5 min；加入HRP标记的二抗室温2 h，孵育后TBST洗涤4次，每次5 min；ECL试剂盒显影，Image J软件分析灰度值，实验共重复6次。

1.8 JC-1法检测Müller细胞线粒体膜电位 倾去各组Müller细胞培养基，预冷PBS洗涤1次，依次加入1 ml新培养基及1 ml JC-1染色液，混匀于培养箱中37℃装载探针20 min。装载探针后，将配置的JC-1染色缓冲液清洗各组Müller细胞2 次。荧光显微镜下观察分析。

2 结果

2.1 各组Müller细胞形态及细胞生长状态 通过显微镜简单观察可发现，高糖组细胞生长缓慢，胞体肿胀，细胞边缘折光性增强。与高糖组相比，NRG-1处理组上述状态有所改善(图1，封2)。

2.2 MTT法检测Müller细胞活力 与对照组相比，高糖组细胞活力明显降低；而与高糖组相比，NRG-1处理组细胞活力有所增加(P均<0.01)，见表1。

2.3 各组Müller细胞丙二醛含量及SOD活力 与对照组相比，高糖组丙二醛含量明显增加，SOD活力明显降低。而与高糖组相比，NRG-1处理组丙二醛含量明显减少，SOD活力明显增加(P均<0.01)，见表1。

表1 3组细胞活力、丙二醛含量、SOD活性比较

2.4 流式细胞仪检测结果 与对照组相比，高糖组细胞凋亡率明显增加；而与高糖组相比，NRG-1处理组细胞凋亡率明显降低(P均<0.01)，见表2，图2(封2)。

2.5 Western印迹检测结果 与对照组相比，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，促凋亡Bax蛋白表达明显增加，Bcl-2/Bax比值降低；而与高糖组相比，NRG-1处理组Bcl-2表达明显增加，Bax表达明显降低，Bcl-2/Bax比值升高(P均<0.01)，见图3，表2。

2.6 3组Müller细胞线粒体膜电位 JC-1在正常线粒体聚集呈现红色荧光，而在线粒体损伤、膜电位降低时成单体呈现绿色荧光。与对照组相比，高糖组Müller细胞线粒体膜电位明显降低；而与高糖组相比，NRG-1处理组线粒体膜电位明显增加(P均<0.01)，见图4(封2)，表2。

表2 3组Müller细胞凋亡率、Bcl-2、Bax表达比较

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3 讨论

研究表明，除微血管病变外，视网膜神经组织病变在糖尿病视网膜病变的发展中也非常关键，其主要病理表现有Müller细胞凋亡、谷氨酸堆积的毒性作用等[7-9]。本研究对正常的视网膜Müller细胞株进行高浓度葡萄糖处理进而模拟糖尿病视网膜病变时视网膜Müller细胞的损伤状态，结果发现，高糖状态下，Müller细胞生长缓慢，胞体肿胀，随着培养时间的延长，氧化应激反应增强，最终会引起Müller细胞的凋亡。

Müller细胞为视网膜胶质细胞，可跨越整个视网膜，几乎与每种细胞类型都有接触，其独特的位置使其对保持视网膜稳态尤为重要[1]。视网膜功能正常时，Müller细胞可调节神经递质循环，防止谷氨酸毒性，通过空间缓冲并重新分配离子，参与视网膜循环，从而调节视网膜营养供应。任何对视网膜环境的干扰都会影响Müller细胞的正常功能，从而参与糖尿病视网膜病变的发生[10]。氧化应激是细胞组织病变时，活性氧簇生成增多攻击细胞及组织的现象[11]。研究发现，Müller细胞损伤与氧化应激水平增强有关，氧化应激增强最终会引起Müller细胞的凋亡[12-13]。丙二醛是脂质过氧化代谢产物，SOD是自由基清除剂。丙二醛含量上调，SOD活性下降，可间接反映组织氧化应激程度[14]。本研究发现，高糖环境下Müller细胞生长缓慢，胞体肿胀，丙二醛含量升高，SOD活性降低，细胞活力明显下降，而细胞凋亡率明显增加，提示高糖环境下会引起Müller细胞氧化应激增强，从而导致细胞凋亡。对高糖环境下的Müller细胞给予NRG-1治疗后，丙二醛含量降低，SOD活性增加，细胞活力明显增加，而凋亡率明显下降。说明NRG-1可降低氧化应激水平，抑制高葡萄糖诱导的Müller细胞凋亡。NRG-1在神经病变领域一直备受关注。最新研究发现，NRG-1通过细胞外信号调节激酶5依赖的丝裂原活化蛋白激酶途径，减缓脑缺血-再灌注损伤的病变[15]。另外，NRG-1还可通过调节酪氨酸激酶受体2受体通路，缓解脊髓运动神经元相关疾病的损伤[16]。也有研究发现，NRG-1通过调节小胶质细胞炎性反应，对脑卒中大鼠具有神经保护作用[17]。Müller细胞轴突内含有丰富的线粒体，糖尿病状态下易造成线粒体损伤，从而导致线粒体膜电位降低，凋亡相关蛋白表达异常，最终引起细胞凋亡。本研究发现，高糖环境下Bcl-2表达下降，Bax表达增加，Bcl-2/Bax比值降低，线粒体膜电位降低，细胞凋亡率增加，提示高糖环境下Müller细胞的凋亡可能与线粒体凋亡通路有关。给予NRG-1处理后，Bcl-2表达增加，Bax表达下降，Bcl-2/Bax比值增加，线粒体膜电位也随之增加，细胞凋亡率明显下降，说明NRG-1可抑制Müller细胞的凋亡，其机制可能与抑制线粒体凋亡途径有关。

综上所述，高糖环境下可激活氧化应激反应，从而诱导Müller细胞凋亡。NRG-1可抑制高糖诱导的Müller细胞凋亡，其机制可能与抑制线粒体凋亡途径有关。但因糖尿病发病机制复杂，NRG-1对糖尿病时Müller细胞损伤的作用还有待进一步探讨。