牟明芳,方慧祥
(1.云南省执业药师注册中心,云南 昆明 650101;2.曲靖市食品药品检验检测中心,云南 曲靖 655000)
妇炎安康胶囊没有对处方中任何一味中药进行含量测定。本文参照中国药典[1]及有关文献[2],建立了HPLC法测定妇炎安康胶囊中绿原酸的含量的方法,为妇炎安康胶囊的质量标准提升提供参考。
岛津LC-20A型高效液相色谱仪(配有四元泵,自动进样器,VCD检测器,柱温箱,真空在线脱气机,Chemstation化学工作站)(日本岛津公司),METTLER AE240型电子天平(瑞士梅特勒公司)。
妇炎安康胶囊(云南省曲靖市第一人民医院制剂室,批号:20170302,20170501,20170802,规格:0.4 g/粒)。绿原酸对照品(购自中国食品药品检定研究院,批号:110753-201716,含量:99.3%)。乙腈(德国默克公司)为色谱纯,水为双蒸水,其余试剂均为分析纯。
2.1.1 对照品溶液:精密称取绿原酸对照品适量,用50%甲醇制成每1 mL含绿原酸503.781 μg的对照品溶液储备液,精密量取对照品储备液1 ml,置10 ml容量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,即得对照品使用液(质量浓度为50.3781 μg/mL) 。
2.1.2 供试品溶液:取妇炎安康胶囊10粒,混匀,称取约0.6 g(相当于1.5粒的样品),精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇25 mL,密塞,称定重量,超声(300 W,40 Hz)提取30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,即得供试品溶液。
2.1.3 阴性样品溶液:按处方比例及工艺制法,制得不含金银花的阴性样品。按“2.1.2”项下方法制成阴性样品溶液。
色谱柱:依利特C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱温为30℃;流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液(17:83);流速为1.0 mL/min;检测波长为327 nm;进样量:10 μL。
分别精密吸取“2.1.1”项下的对照品储备液0.2、0.5、1.0、2.5、5.0 mL分别置10 mL容量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,即得标准系列。分别取10 μl进样,记录峰面积。以绿原酸的质量浓度(x)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标,进行线性回归,回归方程为y=24942x+1396,r=1.0000(n=5)。结果表明,绿原酸的质量浓度在10.0756~251.8905μg/mL的范围内与对应峰面积呈良好的线性关系。绿原酸对照品、供试品及阴性样品的色谱图见图1。
图1 高效液相色谱图
精密吸取“2.1.1”项下的对照品使用液,在“2.2”项下的色谱条件,连续进样6次,记录峰面积。结果,峰面积RSD为0.16%(n=6)。表明仪器精密度良好。
吸取“2.1.3”项下的阴性样品溶液,在“2.2”项下的色谱条件测定,结果阴性样品在与对照品保留时间相应位置上,没有相应的色谱峰,表明阴性样品不干扰测定。
取同一批样品(批号:20170302)6份,按“2.1.2”项下制备,在“2.2”项下的色谱条件测定绿原酸的含量,其含量的RSD为0.97%。
取“2.1.2”项下制备的同一样品,室温下放置,分别以0,2,4,8,16,24 h时,在“2.2”项下的色谱条件测定,记录峰面积。结果,RSD为1.09%(n=6)。表明样品24 h内稳定。
取已测定含量的妇炎安康胶囊(批号:20170302)6份,每份约0.3 g,精密称定,精密加入绿原酸对照品储备液1.25 ml,再精密加入50%甲醇23.75 mL,按“2.1.2”项下操作。在“2.2”项下的色谱条件测定,测得绿原酸的加样回收率见表1。
表1 加样回收率试验结果(n=6)
取3批妇炎安康胶囊,按“2.1.2”项下的方法制备,在“2.2”项下色谱条件测定含量。结果见表2。
表2 样品含量测定结果(n=3)
对用不同浓度的甲醇(50%、75%、100%)作为提取溶剂,超声和回流两种提取方法,以及在以上基础上提取时间(15、30、45、60分钟)上进行比较,发现当浓度和提取时间均相同时,超声和回流提取效率差异不大,但回流方式杂质偏多,当用50%的甲醇超声提取30分钟时,提取效果较好且杂质少,给分离带来方便。从而确定为本试验的提取方法为50%的甲醇超声提取30分钟。
取绿原酸对照品的50%甲醇溶液在200 nm~550 nm范围内进行紫外扫描,绿原酸在327 nm处有最大吸收。将检测波长定为327 nm。
把流动相初步定为甲醇-0.1%磷酸溶液系统,经过对流动相比例进行反复调整,发现当流动相比例为甲醇-0.1%磷酸溶液(17:83)时,分离良好,最终确定为甲醇-0.1%磷酸溶液(17:83)为本实验流动相。
本方法专属性强、精密度高、分离度好,可用于测定妇炎安康胶囊中绿原酸的含量。