柿饼霉菌分离及污染防治研究

石 娜 娜

(潍坊工程职业学院，山东 青州 262500)

柿是我国特色水果之一，品种繁多，据全国柿资源调查统计，我国柿品种有1058种，其中有很多是我国的特有品种[1]，因其营养丰富，被誉为“果中圣品”。根据口感的不同分为涩柿、甜柿两大类，其中，涩柿是指果实成熟时不能自然脱涩，需要进行人工脱涩处理后才能食用的一类品种，主要有磨盘柿、小萼子(又名牛心柿)、镜面柿、恭城水柿(又称月柿)等[2]。根据《中国农业统计资料》，2015年全国柿果产量379万吨，其中山东做为主要产区，柿果产量超过10万吨，原产于青州、临朐的小萼子做为优良品种被广泛推广种植。

柿饼是我国主要的柿果加工产品之一，富含果糖、葡萄糖、天然有机酸、锰、钙、维生素等，是养生食品中的佳品[3]。但加工方式简单，主要以传统手工加工为主，卫生质量问题令人担忧，其中影响柿饼质量安全的主要问题是加工、储存、运输过程中柿饼会发生霉变，因此探究安全有效的霉菌控制技术至关重要。

本研究选择传统加工过程中的霉变柿饼,对其进行霉菌分离和鉴定,并研究不同的抑菌方法对污染菌种生长的抑制效果,通过湿度、含水量探索控制柿饼霉变的有效措施。

1 试验材料及方法

1.1 试验材料

1.1.1 柿饼

小萼子加工柿饼，潍坊工程职业学院应用化学与食品药品学院提供(经传统晾晒加工制得)。

1.1.2 培养基

孟加拉红培养基(g/L)：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、琼脂20g、孟加拉红溶液100ml、蒸馏水1000ml、氯霉素0.1g；

PDA培养基(g/L)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、pH自然。

1.2 试验方法

1.2.1 含水量对柿饼霉变的影响

将含水量分别为15%、25%、30%、35%、40%的柿饼置于空气相对湿度60%的培养箱中,25℃下培养,每个处理3个柿饼，并重复3次,每5d观察1次，对霉变柿饼进行菌落计数，研究柿饼含水量对柿饼霉变的影响。

1.2.2 环境湿度对柿饼霉变的影响

将1.2.1单因素试验中的最优含水量柿饼，密封于相对湿度分别为50%、60%、70%、80%、90%的培养箱中，25℃下培养,每个处理3个柿饼，并重复3次,每5d观察1次，对霉变柿饼进行菌落计数，研究相对空气湿度对柿饼霉变的影响。

1.2.2 霉变柿饼中霉菌的分离及形态学鉴定

取柿饼霉变部位组织10g,加入装有90ml蒸馏水的250ml三角瓶中,200r/min震荡30min。对悬浊液进行系列稀释，取稀释液0.1ml在孟加拉红平板中涂布，25℃培养5～7d。挑取目的霉菌菌落,于PDA平板中纯化并保存。

对筛选到的霉菌菌株进行形态学鉴定[4]，包括菌落形态及水浸片观察。

1.2.3 不同处理对黑曲霉菌种生长的影响

(1)紫外照射对黑曲霉生长的影响

将纯化的黑曲霉菌株用生理盐水进行系列稀释，选择浓度为1×106的cfu/mL的孢子悬液备用。取0.1mL于PDA固体平板中进行涂布。然后在无菌超净工作台中打开培养皿盖，分别给予0min、10min、15min、20min、25min的紫外灯照射处理。每个处理3个平行，28℃下培养3～5天，观察每个平板中霉菌的生长情况。

(2)二氧化硫对黑曲霉生长的影响

同(1)所述方法，制备浓度为1×106的cfu/mL的孢子悬液。以2%的接种量接种于PDA液体培养基中。PDA液体培养基中分别添加0g/L、10g/L、15g/L、20g/L的二氧化硫。每个处理3个平行，28℃、280r/min培养3～5天，观察每个平板中霉菌的生长情况。

2 试验结果

2.1 含水量对柿饼霉变的影响

含水量对柿饼霉变的影响试验结果如表1所示，通过该试验发现当含水量小于等于20%时，柿饼没有发生霉变，可以长期贮存；当含水量超过30%时，柿饼储存30天便可发生霉变。可知，柿饼的含水量越高，霉变发生的时间会越早，霉变程度越严重。

表 1 含水量对柿饼霉变的影响

2.2 环境湿度对柿饼霉变的影响

选择含水量为20%左右的柿饼对其进行环境湿度单因素实验，结果如表2所示。

表 2 环境湿度对柿饼霉变的影响

通过该试验发现当环境湿度保持在50%时，柿饼保存50天内均没有发生霉变；当环境湿度超过60%时，柿饼储存40天便可发生霉变；柿饼加工及储存的环境湿度越大，霉变发生的时间会越早，霉变程度越严重。

2.3 霉变柿饼中霉菌的分离及鉴定

图1 黑曲酶显微、平板菌落形态

经过分离筛选，霉变柿饼中分离的微生物有2种，其中一种占80%以上，将该菌种纯化，通过水浸片显微镜观察、菌落形态观察等形态学特征(图1)，初步判定该菌种属于黑曲霉属(Aspergillus)。

2.4 不同处理对黑曲霉菌种生长的影响

2.4.1 紫外照射对黑曲霉生长的影响

图2 紫外照射对黑曲酶生长的影响

紫外照射对微生物生长有抑制作用，对黑曲酶的作用效果如图2所示。没有经过紫外照射时菌数为7×104cfu/mL,当给予15min的紫外照射时仅有400cfu/mL的黑曲霉生长，99.4%的霉菌被抑制。由图可知，给予超过15min的紫外照射处理即可有效抑制该菌的生长。

2.4.2 二氧化硫对黑曲霉生长的影响

限量的SO2能有效抑菌或杀菌，其对黑曲霉的抑制效果如图3所示。没有添加SO2时菌数为7.5×104cfu/mL,当添加15g/L的SO2时仅有5600cfu/mL的黑曲霉生长，92.5%的霉菌被抑制。由图可知，添加超过15g/L的SO2时可有效抑制该菌的生长。

图3 二氧化硫对黑曲霉生长的影响

3 结论

柿饼发生霉变是影响当前市场中柿饼质量的主要因素之一，崔雨琪等从土壤中分离得到一株产酸能力较高的真菌，经形态学及ITSrDNA基因序列分析鉴定为黑曲霉[5]，张倩等从发霉柿饼中筛选出两株霉菌，经过形态学及分子生物学鉴定，其中一株为黑曲酶[6]。本文对引起柿饼霉变的主要菌种进行了分离纯化，通过形态学初步鉴定为黑曲酶，这与崔雨琪、张倩等人的研究结果相一致。同时选择不同的抑菌方法对该霉菌的生长进行抑制,发现引起柿饼加工、储藏过程中发生霉变的因素有环境湿度、柿饼的含水量等，通过控制环境温度和含水量可减少霉变率，同时，可采用熏硫、紫外照射等方式防止霉变。