双菌种混合发酵制备银瓜酵素的生产工艺研究

张 媛 媛

(潍坊工程职业学院，山东 青州 262500)

青州弥河银瓜表皮洁白、个大、肉脆、味甜、香气浓郁，更重要的是其含糖量高、且营养丰富。银瓜含有脂肪酶、多酚氧化酶、蛋白酶等丰富的酶类，每100g瓜中含糖6.75g，其中含蔗糖3.75g、葡萄糖1.25g、果糖 1.75g，含维生素C18.6g，含总酸0.095g，且可溶固形物含量最高可达13%[1]。《食疗本草》中有记载:银瓜具生津止渴缓解便秘、利尿、除烦热、通三焦之功效。

酵素是一类以酵母菌等益生菌为发酵剂，以果蔬等食材为原料发酵而成，含有丰富酶类、维生素、矿物质及多种生物活性成分的功能性发酵液体或固体。酵素中含有脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶等酶类以及多种维生素、乳酸等物质，具有促进正常新陈代谢，增强机体免疫，消炎、抗菌、抗氧化、解酒护肝、美白、抗癌等功效[2]。目前日本、韩国、台湾等地的酵素产品在国内盛行，而我国自产酵素产品品种虽多，但传统酵素生产周期较长、成本高，绝大多数酵素食品都依赖于进口，且市场价格昂贵。因此在保证产品质量、充分利用资源的基础上，对其制备方法进行科学研究具有巨大的潜在价值，也是酵素研究需要迫切开展的课题。

银瓜营养丰富，但由于青州弥河银瓜成熟集中，采收时气温高，后熟较快，不易长时间贮藏。银瓜存放时，糖分、氨基酸等营养成分也会快速减少，不利于保存，给瓜农造成经济损失。由于银瓜种植的地域特点等原因，银瓜酵素国内外少见报道，本文采用弥河银瓜为原料，通过复合菌种发酵得到银瓜酵素原液，再经过后序加工制成营养均衡的功能性饮品，既为酵素市场提供了一种营养产品，又解决了青州银瓜不耐储存的问题。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料：青州弥河银瓜；购于青州市弥河银瓜种植基地；白砂糖市售；市售活性酿酒干酵母(安琪酵母500g/袋)；醋酸菌(为实验室保藏)。

1.1.2 仪器：紫外/ 可见分光光度计(上海元析仪器有限公司，V-5000型)；酸度计(上海佑科仪器有限公司，数字酸度计PHS-3C)；糖度计(上海仪电物理光学WZS系列手持式糖度计)。

1.2 加工方法

挑选新鲜成熟的银瓜 → 无菌水冲洗→ 切分打浆→加入果胶酶→ 过滤→ 调节糖度(12%)→ 灭菌→ 接种混合菌种→ 密封发酵18天→ 酵素原液

1.3 检测方法

1.3.1 粗酶液的分离

将发酵好的酵素原液在4 ℃下5000 r/min离心20 min，取其上清液即为粗酶液。

1.3.2 脂肪酶酶活的测定方法

脂肪酶定义：30 ℃下，1 min内产生1μmol油酸所需的脂肪酶量为一个活力单位(U)。

采用黄锡荣等的方法[3]，取两只50mL 具塞锥形瓶，分别加入50mmol/L AOT 的异辛烷溶液4.5mL、0.5mL三油酸甘油酯，移取 45μL 1.0mg/mL的酶液加入其中的一瓶中(作样品)，另一只瓶加入45μL 66.7mmol/L磷酸缓冲液(作空白)，将两只锥形瓶放入30 ℃恒温振荡水浴中保温20min。各从两瓶中移取0.4mL反应液于两支10mL具塞离心管中，再于离心管中各加入4.6mL苯和1.0mL 5 %的CuAc2吡啶溶液，快速混合以终止酶促反应。各取上清液于1cm玻璃比色皿中，以空白为参比，测加酶反应液样品在715nm处的吸光度A。根据吸光度A值，在油酸工作曲线上用内插法计算出油酸含量，再根据酶活定义算出酶活及比活。

1.3.3 蛋白酶酶活的测定方法

参考国标SB/T10317-1999 《蛋白酶活力测定法》。

蛋白酶酶活定义：40℃1min水解酪蛋白产生1μg酪蛋白定义为一个蛋白酶活力单位(U)。

1.3.4 超氧化物歧化酶活力测定方法

参考GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性国标测定方法》。

1.3.5 感官评价

以10个人为一组进行感官评价，共三组。在相同的环境和条件下，对最终银瓜酵素的感官指标进行打分。感官指标包括酵素的色泽、气味以及口感，其中口味口感占45%，色泽占30%，气味占25%，总分为100分。三类分数综合相加之后，总分取平均分。分数分为四个等级，80～100分为质量优的，质量良好的70～79分、60～69分为可以接受的，低于60分为质量差的。

1.3.6 酵母菌、醋酸菌发酵条件的优化

本试验采组合试验设计，根据酵母菌及醋酸菌的接种量为因素试验结果分析确定因素水平，以蛋白酶酶活、脂肪酶酶活为响应值，试验以随机次序进行，重复三次，分析优化乳酸菌、酵母菌发酵条件。

表1 酵母菌和醋酸菌添加量

1.4 菌种的活化

酵母菌的活化：将活性干酵母加入到2%的葡萄糖中，在30 ℃的条件下活化3～5h，然后按比例加入发酵液。

醋酸菌的活化：活化菌种在MRS液体培养基中进行，32 ℃培养箱中传代2～3次，使菌种数量达到109CFU/mL，然后按比例加入发酵液。

酵母菌计数采用血球计数板法。醋酸菌菌落数根据平板计数法，参照国标GB4789.2-2016《食品微生物菌落总数的测定》。

2 结果与讨论

蛋白酶、脂肪酶和超氧化物歧化酶是酵素产品的重要功效酶，通过表2中测定结果可以看出，酵母菌和醋酸菌的添加比例及接种量对酵素中脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶的活力影响显著。

2.1 接种量对脂肪酶活力的影响

脂肪酶是一类水解油脂的酶，可以水解天然的油脂，酵素产品的减肥作用正是源于此酶的功能，结果表明当酵母菌添加量7.5%，醋酸菌添加量5%，总接种量为12.5%时，脂肪酶的活力最高(见表1、表2)。

2.2 接种量对蛋白酶活力的影响

蛋白酶是催化蛋白质水解的酶，在体内能帮助人体消化食物中的一些大分子的蛋白质，结果表明当酵母菌添加量7.5%，醋酸菌添加量5%，总接种量为12.5%时，蛋白酶的活力最高(见表1、表2)。

2.3 接种量对超氧化物歧化酶活力的影响

超氧化物歧化酶可以帮助机体清除超氧阴离子自由基，具有抗氧化防衰老等功效，结果表明在酵母菌添加量10%，醋酸菌添加量5%时，总接种量为15%，超氧化物歧化酶的活力最高(见表1、表2)。

综上结果分析，酵母菌含有丰富的酶类，随着酵母菌的添加比例的提高脂肪酶和蛋白酶活力有显著提高，超氧化物歧化酶的活力在酵母菌添加量为10%，醋酸菌接种量5%时，活力最高，但在酵母添加量为10%，醋酸菌添加量为5%时，由于总接种量过大，不利于菌种的繁殖和生长，会引起酵素的脂肪酶和蛋白酶活力相对低些，超氧化物歧化酶则受到的影响较小(见表1、表2)。

表2 脂肪酶、蛋白酶与超氧化物歧化酶活力变化U

2.4 感官评价

通过感官评价结果可以看出，本文采取的发酵工艺使银瓜酵素在口味上得到了很大的改善。在酵母菌添加量7.5%，醋酸菌添加量5%，总接种量为12.5%时，酵素感官评价分数最高(见表1、表3)。

表3 不同接种比例的银瓜酵素感官对比(平均分)

分析原因，醋酸菌接种比例过大，会引起酵素的气味较冲，且口感酸涩杀口，适当的提高酵母的比例可以让酵素色泽透亮，气味带有银瓜的芳香，且口感酸度适宜。

3 小结

本研究设计了一种银瓜酵素的制作工艺，综合考评最终酵素的脂肪酶、蛋白酶及超氧化物歧化酶的活性，在最大程度满足目标的条件下确定发酵菌种比例为：酵母菌7.5%，醋酸菌添加量5%，总接种量为12.5%，感官评价评分为86.82。

目前国内一般酵素的制作工艺，大多是把多种蔬菜水果处理后进行自然发酵成蔬果酵素原液，这样的传统工艺很难控制酵素的质量和发酵时间，且其中的菌种种类多、复杂，而本研究利用酵母菌和醋酸菌的互利共生关系，使酵素朝着我们预期的方向发展，双菌种混合发酵生产的酵素营养价值得到大幅度提升。双菌种混合发酵既可以最大程度的保留银瓜原有的丰富营养，还能产生多种活性酶等有益成分，下一步工作将继续研究酵素产品的调配方式，生产出营养口味符合大众要求的酵素产品。此外，还要对银瓜酵素的生产工艺条件进行优化， 确定银瓜酵素的工业化生产工艺参数，生产出质优味美的银瓜酵素，使之成为极具特色的酵素产品，更好地服务当地的经济建设。