百里香精油的提取工艺及化学成分分析

王娣，程柏，丁莉，任茂生

(蚌埠学院 生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

百里香(Thymiherba)是百里香(ThymusmongolicusRonn.)植物的地上部分， 每年在夏秋季枝叶繁茂时采割，阴干后使用。百里香资源丰富，在我国主要分布在淮河以北、甘肃、陕西、宁夏等地[1-4]。我国古代著作《嘉祐本草》、《御制本草品汇精要》等书籍中均有记载[5,6]。现代研究表明百里香植株中含挥发油、黄酮类、多糖、三萜类等化学活性物质，具有抗菌消炎、抗肿瘤等药理作用[7-9]。同时百里香也是药食同源植物，食品上常用于牛、羊肉除腥提鲜，是一种天然调味品，有较高的药用和食用价值[10,11]。

超高压技术作用效果快速、高效，是在常温或较低温度下，对物料迅速施加100～1000 MPa压力，在食品活性成分提取、物料改性、灭菌、保鲜等方面有良好的效果[12-14]，可以应用在植物精油、茶多酚、总黄酮、花色苷和红景天苷等活性成分的提取上[15-19]。贾春晓等[20]利用超高压萃取花椒精油，并对提取的精油进行了化学成分分析；武艳梅超高压提取柚皮精油，精油提取效果高效、节能；王娟等[21]采用超高压、超声波与微波辅助3种方法萃取茶树花精油，发现超高压精油提取率远高于超声波法与微波辅助法，这些研究表明超高压技术可以应用在植物精油的提取上。本文利用超高压法提取百里香精油，采用响应面法对百里香精油提取工艺进行优化；采用气相色谱-质谱联用技术对提取的百里香精油化学成分进行分析，为百里香资源的进一步开发利用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

百里香：产于陕西省吴起县，低温烘干，粉碎过筛备用；无水乙醇：中国医药(集团)上海化学试剂公司；其他试剂：均为分析纯。

XFB-200中药粉碎机 吉首中诚制药机械厂；HPP.L2B-600/0.6超高压设备 天津华泰森淼生物工程技术有限公司；MZKR022-R高速冷冻离心机 德国Hettich公司；RE200B旋转蒸发仪 巩义予华仪器有限责任公司；CHR-ST冷冻干燥机 德国Christ公司；Trace MS型气相色谱-质谱仪 美国Finnigan公司。

1.2 百里香精油的超高压萃取工艺优化

将备好的百里香粉10.0 g装入聚乙烯袋中，加入一定体积的无水乙醇，真空密封；放入超高压设备中，在一定压力下进行常温保压提取；提取结束后卸压，在4000 r/min离心10 min得到上清液，用旋转蒸发仪进行真空浓缩，浓缩液氮吹至无溶剂味，得到深棕黄色芳香精油，密封后于4 ℃冰箱中冷藏、备用。

1.2.1 单因素试验

1.2.1.1 超高压压力对百里香精油提取的影响

保压时间4 min，料液比1∶30(g/mL)，粉碎度为50目，研究不同压力(100，200，300，400，500 MPa)对百里香精油提取的影响。

1.2.1.2 料液比对百里香精油提取的影响

在400 MPa下，保压时间4 min，粉碎度为50目，研究不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL)对百里香精油提取的影响。

1.2.1.3 保压时间对百里香精油提取的影响

在400 MPa下，料液比1∶30(g/mL)，粉碎度50目，研究不同保压时间(2，4，6，8，10 min)对百里香精油提取的影响。

1.2.1.4 粉碎度对百里香精油提取的影响

在400 MPa下，保压时间4 min，料液比1∶30 (g/mL)，研究不同粉碎度(30，40，50，60，70目)对百里香精油提取的影响。

1.2.2 响应面优化试验

根据Box-Behnken试验设计原理，利用Design-Expert 8.0软件以百里香精油提取压力、料液比、粉碎度作为自变量，以百里香精油提取量为响应值，建立回归方程模型进行响应面分析，试验因素和水平表见表1。

表1 响应面试验因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3 百里香精油成分GC-MS定性分析

气相色谱仪条件：DP-5 MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。升温程序：初温50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升至200 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min；进样口温度250 ℃；载气为高纯氦气，流速1 mL/min；进样量1 μL，分流比20∶1。质谱条件：离子源温度250 ℃，电离能量EI 70 eV，接口温度250 ℃，扫描范围15～450 nm。

2 试验结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 压力对百里香精油提取的影响

图1 压力对百里香精油提取的影响Fig.1 Effects of pressure on the extraction of thyme essential oil

由图1可知，百里香精油提取压力在200～400 MPa时，百里香精油的提取量随着压力的增加而逐渐提高；当提取压力>400 MPa后，百里香精油提取量基本趋于稳定。可能是超高压在植物细胞内外形成压力差较大，植物细胞结构遭到破坏，提高了溶剂扩散动力，因而有效成分的渗透速率也随之提高，从而达到提取的效果；当提取压力>400 MPa时，细胞已被破坏，继续增加压力对精油提取效果的影响不大，因此综合考虑，在优化试验中选择提取压力400 MPa为宜。

2.1.2 料液比对百里香精油提取的影响

由图2可知，料液比在1∶10～1∶50(g/mL)之间时，随着料液比的增大，百里香精油提取量不断增加并趋于稳定；料液比<1∶30(g/mL)时，百里香精油提取量的增加幅度较大。料液比的增加能提高传质推动力，加速百里香精油从植物细胞扩散到液相中，但料液比增大到一定程度后，传质推动力不再提高，百里香精油提取量趋于稳定。综合考虑，在优化试验中选择料液比1∶30(g/mL)为宜。

图2 料液比对百里香精油提取的影响Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on the extraction of thyme essential oil

2.1.3 保压时间对百里香精油提取的影响

图3 保压时间对百里香精油提取的影响Fig.3 Effects of holding time on the extraction of thyme essential oil

由图3可知，保压时间对百里香精油提取量的影响不大。压力较高时，溶剂的渗透速率和溶质的传质速率很大，细胞内、外有效成分达到平衡所需的时间非常短，4 min后精油提取量增加不大，变化不明显，进一步延长保压时间并不能显著提高百里香精油提取量；且保压时间4，6，8 min没有显著性差异(P>0.05)。

2.1.4 粉碎程度对百里香精油提取的影响

图4 粉碎度对百里香精油提取的影响Fig.4 Effects of grinding degree on the extraction of thyme essential oil

由图4可知，随着百里香粉碎度的增加，百里香粒径不断减小，百里香精油提取量呈现先增后降后趋于平稳的趋势并略有下降，在50目时达到最大值。分析原因可能是随着百里香粒径的减小，比表面积逐渐增大，精油的扩散速度随之加快；若百里香粒径过小，虽能提高浸提效果，但微粒的吸附作用也在加强，反而影响了精油的扩散，使精油含量略下降。综合考虑，在优化试验中粉碎度选择50目为宜。

2.2 响应面法优化百里香精油提取工艺结果

根据单因素试验结果，选取提取压力、料液比、粉碎目数为百里香精油超高压提取优化试验的3个因素，固定保压时间为4 min。响应面分析方案与结果见表2。对此模型进行回归分析，见表3。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiment

利用Design-Expert 8.0.6软件对表2试验数据进行线性拟合，获得超高压提取百里香精油得率(mg/g)，对料液比(A)、压力(B)、粉碎度(C)的二次回归模型方程为：Y=11.15-0.19A+0.19B+0.16C-0.089AB-0.10AC-0.18BC-0.54A2-0.63B2-0.17C2。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

续 表

注：“**”表示差异极显著，P<0.01。

图5 压力和粉碎度的变化对百里香精油提取影响Fig.5 Effects of pressure and grinding degree on the extraction of thyme essential oil

由图5可知，响应面为开口向下的凸形曲面，具有极高值，在一定范围内，百里香精油提取量随着压力和粉碎度的增加，呈现先增加后减少的趋势；百里香精油提取量在压力方向的曲线较粉碎度方向的更为陡峭，说明压力对百里香精油提取影响更显著，这与表3方差分析表一致。

2.3 验证试验

由软件分析得到最佳提取条件为压力409.87 MPa，料液比1∶27.71，粉碎度54.93目，在此最优条件下百里香精油提取量为11.2252 mg/g。结合实际操作得到提取条件为：压力410 MPa，料液比1∶28，粉碎度50目，保压时间4 min，提取温度为室温，得到百里香精油提取量平均值为11.236 mg/g。

2.4 百里香精油成分鉴定结果

用气相色谱-质谱联用仪对百里香精油进行分析，得到百里香精油的GC-MS 总离子流图，见图6。由图6可知，共分离出55种化合物，利用NBS75K 标准质谱库-计算机联机检索，结合查阅质谱手册并与文献核对，共鉴定出46种化合物，采用面积归一化法测定各种成分的相对质量分数，结果见表4。

图6 百里香精油的GC-MS 总离子流图Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of thyme essential oil

表4 百里香精油化学成分及含量Table 4 Chemical components and content of thyme essential oil

GC-MS鉴定出的46种化合物占总量的97.949%，含量在1%以上的化合物共14个，占总量的91.127%；含量在3%以上的化合物8个，占总量的77.912%；含量最高的是百里酚(43.925%)和对-聚伞花素(16.112%)，占总量的60.037%。从化合物类型来看，百里香精油所含成分主要为烯类、萜类、酚类、醇类、酯类，它们易挥发且呈现各自特殊的芳香气味，构成百里香精油的特色，如冰片具有类似胡椒和薄荷的香气。从鉴定出的化合物相对分子质量来看，较小相对分子质量化合物占绝大多数，鉴定的化合物中，最小相对分子质量为128，最大相对分子质量为220，相对分子质量为136，150，154，204的化合物最多，主要为带环的烯烃类(单萜)；相对分子质量为150 的化合物有8种，其中百里酚和香芹酚是百里香精油的主要成分，是含氧单萜的同分异构体，百里香酚含量较高，占总量的43.925%，香芹酚较少，为2.655%，这两种化合物含量的高低也是衡量百里香精油质量的重要指标。倍半萜类物质有9种，它们的相对分子质量为204，除石竹烯含量为2.870%外，其他物质含量都不大，属于百里香精油重要的尾香成分化合物。出峰较晚，相对分子质量为220 的化合物有3种，其中氧化石竹烯含量较多，占总量的1.75%。

3 结论

在单因素试验基础上，使用Design-Expert 8.0.6软件，采用响应面试验优化超高压百里香精油提取工艺，结合实际情况，确定最佳工艺条件为：压力410 MPa，料液比1∶28，粉碎度50目，保压时间4 min，提取温度为室温，得到百里香精油提取量平均值为11.236 mg/g。GC-MS鉴定出的46种化合物，其中百里酚和对-聚伞花素(16.112%)含量较高，分别占总量的43.925%和16.112%。