血必净注射液对脓毒症患者血浆组蛋白H4的影响及意义*

王力军 ，王镜媛 ，郭 菲 ，王紫怡 ，宋瑞雯

（1.天津医科大学总医院急诊医学科，天津 300052；2.天津医科大学总医院空港医院急诊医学科，天津 300308；3.天津中医药大学管理学院，天津 301617）

机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍即脓毒症，进一步可发展为脓毒性休克，脓毒症病死率约30%～50%[1-2]。目前脓毒症发病机制尚未完全明确[1]。分子标志物是脓毒症研究热点，但尚缺乏评估严重程度和预后的良好指标[3]。近期研究显示，胞外组蛋白（EH）剂量依赖性刺激炎症介质释放、活化凝血、诱导中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成，导致脓毒症小鼠内皮细胞损伤、器官功能衰竭甚至死亡[4-6]。EH由 H1、H2A、H2B、H3、H4 5种蛋白构成[7]。输注EH4抗体能阻断蛋白C活化，降低小鼠病死率[4，8]。

血必净注射液由红花、赤芍、川芎、丹参、当归等药物组成，具有抑制炎症介质释放、改善微循环、调节免疫功能、保护血管内皮细胞等功效[9]。本研究主要观察血必净注射液是否通过降低脓毒症患者EH4，从而纠正凝血功能紊乱，调节炎症反应，改善病情严重程度，降低病死率。

1 研究对象和方法

1.1 研究对象 对2017年7月—2018年6月天津医科大学总医院急诊医学科收治的脓毒症患者，采用随机数字表，末尾为奇数者入对照组（30例），偶数者入治疗组（30例）。其中对照组男18例，女12例，平均年龄（64.60±15.82）岁；治疗组男 16例，女14例，平均年龄（65.08±14.68）岁。两组间在年龄及性别上无统计学差异，具有可比性。所有患者（或家属）均告知此研究的目的、研究程序以及参加此研究的利弊，签署知情同意书。本研究经天津医科大学总医院伦理委员会审核通过（IRB2018-152-01）。

1.2 病例纳入标准 序贯器官衰竭评估评分（SOFA），见表1。各系统分数之和即为该患者SOFA分值。在感染的基础上，△SOFA分值≥2分；或快速SOFA分值≥2分时即为脓毒症[1]。符合此标准者即为纳入标准。

1.3 病例排除标准 1）年龄＞80岁或＜18岁。2）肿瘤。3）失代偿性肝硬化。4）急性坏死性胰腺炎。5）慢性终末期肾病。6）孕妇。7）免疫性疾病活动期。8）凝血功能障碍（血小板＜50×109/L、凝血酶原时间＞16 s或纤维蛋白原＜1.0 g/L）。9）不能完成该试验者。

1.4 治疗方法 两组患者均按照脓毒症相关指南进行治疗。治疗组在此基础上，每日静脉静滴0.9%NaCl 100 mL+血必净注射液100 mL，每日2次。连续治疗7 d。

表1 SOFA评分Tab.1 Sequential Organ Failure Assessment score

1.5 观察指标 EH4：患者入院时、24 h及72 h时，抗凝管采血5 mL，4℃保存20 min后3 000 r/min离心10 min。收集血浆，-80℃保存。采用上海广锐生物科技有限公司提供的EH4（批号20171226）检测试剂，用酶联免疫分析法检测EH4水平。

血浆D-二聚体、白介素-6（IL-6）和其他指标由本院检验中心测定。计算患者入院时和72 h疾病严重程度急性生理与慢性健康评分（APACHE评分Ⅱ）、SOFA评分，并随访28 d生存状态。

1.6 统计学方法 SPSS 24.0软件统计分析。定量资料以均数±标准差（x±s）表示，符合正态分布的两组间比较采用两独立样本检验；非正态分布的计量资料比较采用Mann-Whitney U检验。定性资料组间比较采用χ2检验。采用Spearman对EH4与白细胞、血小板、IL-6和D-二聚体进行相关性分析。绘制ROC曲线判断入院时EH4水平与脓毒症预后关系，找出最佳截断点，计算曲线下面积、灵敏度及特异度。P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 两组患者治疗前后各参数的比较 治疗前两组间EH4水平、血浆D-二聚体及IL-6水平无统计学差异（P＞0.05），治疗24 h时具有统计学差异（P值分别为＜0.001、0.04和0.03）。72 h时 EH4水平具有统计学差异（P＜0.05），血浆D-二聚体及IL-6水平均无统计学差异（P＞0.05），见表 2。

表2 两组患者治疗前后各参数的比较（x±s）Tab.2Comparison of parameters between two groups before and after treatment（x±s）

2.2 两组患者入院时及72 h时疾病严重程度的比较 两组患者入院时APACHE II和SOFA分值无统计学差异。72 h时两组间APACHE II评分和SOFA分值具有统计学差异（P＜0.01），见表2。

2.3 EH4水平与各参数的相关性分析 两组患者入院时、24 h及72 h时EH4与白细胞、血小板、IL-6和D-二聚体各参数的相关性分析，见表3。

2.4 入院时EH4水平与72 h时疾病严重程度的相关性分析 入院时EH4与脓毒症患者72 h时APACHEⅡ分值和SOFA分值的相关系数分别为0.71和0.68，见图1和图2。

表3 EH4与各参数的相关性分析Tab.3 Correlation analysis between EH4 and various parameters

图1 EH4与72 h时APACHEⅡ分值相关性分析Fig.1 Correlation analysis between EH4 and APACHE II scores at 72 h

图2 EH4与72 h时SOFA分值相关性分析Fig.2 Correlation analysis between EH4 and SOFA scores at 72 h

2.5 入院时EH4水平与脓毒症患者预后关系 60例患者28 d时存活36例，死亡24例。存活和死亡患者入院时EH4水平分别为（466.83±25.95）和（531.92±41.94）pg/mL，具有统计学差异（P＜0.001）。以此值判断脓毒症患者预后，绘制ROC曲线。曲线下面积为0.930，最佳截断点为501.92 pg/mL，此时EH4判断脓毒症患者预后的灵敏度为79.2%，特异度为94.4%，见图 3。

3 讨论

图3 入院时EH4水平判断预后的ROC曲线Fig.3 ROC curve of EH4 level at admission on predicting prognosis

脓毒症发病机制尚未完全明确。过度的炎症反应和凝血功能障碍是其主要发病机制，多采用抗生素、营养支持、血液净化等方式治疗。而中医学认为其与正虚毒损、络脉瘀滞有关[10]。血必净注射液是根据“四证四法”的辨证治疗原则研制的复方制剂，即活血化瘀法治疗瘀血，清热解毒法治疗毒热，扶正固本法治疗正气不足，通里攻下法治疗痰湿内阻[11]。研究表明血必净注射液可抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、IL-6 和白介素-8（IL-8）等炎症介质的过度分泌[12]。进一步发现其可纠正脓毒症及严重脓毒症凝血紊乱，恢复器官功能，改善血流动力学状态及严重程度，降低病死率[12-15]。本研究发现，血必净注射液能够降低脓毒症患者24 h时EH4水平、血浆IL-6及D-二聚体水平；降低72 h时APACHE II和SOFA评分分值，与Wang F等研究结果一致[12，16]。

3.1 EH4与脓毒症凝血功能障碍 脓毒症患者常伴凝血功能障碍，影响其预后[17]。EH以时间依赖性的方式诱导凝血酶-抗凝血酶复合物（凝血激活的标志物）的生成，加重凝血功能紊乱。注射EH抗体后该复合物显著下降[18]。Dhainaut JF等[19]发现近乎100%的脓毒症患者出现血浆D-二聚体升高，其次为蛋白C降低、凝血酶原时间及部分凝血活酶时间的延长和血小板数量下降。血浆D-二聚体在反映凝血功能障碍方面尤为重要[20-21]。Peng W等[22]发现血必净注射液及EH4均可影响血浆D-二聚体，与本研究结果一致。此外，Yipp BG等[23-24]发现EH导致大量血小板聚集、凝血酶激活和纤维蛋白斑块形成。EH尚可激活Toll样受体（TLR），产生凝血酶，激活和聚集血小板，导致血小板数量下降。本研究发现EH4与血小板之间无明显相关性，可能与样本量小有关，见表3。

3.2 EH4与脓毒症炎症反应 作为损伤相关分子模式的新成员，EH以配体受体的形式与TLR2及TLR4相互作用，通过激活其下游髓样分化因子88（MyD88）蛋白及NF-κB信号通路，启动和调控炎症因子的表达及释放[25]。EH以时间和剂量依赖性的方式诱导白介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8、白介素-10（IL-10）、白介素-18（IL-18）和及 TNF-α 的释放[16，18，24，26]。这些标志物在抗组蛋白治疗后下降[16，27-28]。本研究发现治疗组患者24 h时血浆IL-6水平明显低于对照组，其与EH4有较好的相关性（r=0.69）。Wang Q等[29]发现血必净注射液下调高迁移率族蛋白B1（HMGB1）表达，降低IL-6及TNFα等炎症因子释放。EH4及HMGB1均为内源性损伤相关模式分子成员。推测血必净注射液可能通过降低EH4进而降低IL-6水平。

此外，本研究中两组患者72 h时EH4水平具有统计学差异，但与课题组既往研究的健康志愿者水平近似（数据尚未发表），考虑可能与EH4本身代谢有关。研究表明，盲肠穿孔结扎小鼠后6～30 h可检测到组蛋白，峰值出现在8 h[30-31]。Alhamdi Y等[32]表明EH在脓毒症后10 h开始出现，达峰时间为16～24 h，24 h 后逐渐下降。

4 局限性

首先，血必净注射液治疗后EH4、IL-6与血浆D-二聚体水平均下降，且EH4与IL-6、血浆D-二聚体水平具有较好的相关性，此并不能证明他们之间的因果关系。其次，炎症反应和凝血功能影响因素复杂，本研究中仅将IL-6和血浆D-二聚体作为炎症反应和凝血功能的指标，略显不足。

总之，脓毒症患者EH4水平与疾病严重程度呈正相关，死亡患者EH4水平显著高于存活者。血必净注射液可能通过降低EH4水平，发挥改善炎症反应、凝血功能紊乱和疾病严重程度的作用。EH4既是反映脓毒症严重程度及预后的生物标记物，也是潜在治疗靶点之一。