响应面法优化小球藻超声波破壁技术

郭锁莲 廉想 于雪

摘要 小球藻营养丰富且全面，具有重要的生理功能和保健功效，在营养品、保健品、功能食品方面具有良好的应用前景。然而，由于小球藻的细胞壁十分坚硬，破碎困难，胞内的有效成分不易释放，抑制了其产业化发展。因此，一种安全有效的破壁方法是小球藻产业化发展的关键。该研究采用超声波破壁技术处理小球藻，通过单因素试验考察超声时间、超声波功率、料液比对細胞破碎的影响，并进一步采用Box-Behnken 试验设计和响应面分析法优化其工艺参数。结果表明：通过单因素试验得到破壁效果的影响力大小依次为超声时间、超声波功率、料液比。Design-Expert 8.0.6软件优化的工艺条件为料液比1∶200（g∶mL）、超声波功率为450 W、超声时间为15 min。该条件下细胞破壁率为79.51%，与模型预测值80%非常接近。采用响应面法对超声波破碎藻细胞条件进行优化合理可行。

关键词 小球藻;超声波;破壁;响应面法

中图分类号 S-3   文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）12-0178-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.049

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract Chlorella has been applied in many fields，for its rich，allround and balanced nutrition.The cell wall of Chlorella is very hard to crush，so that the activate component in the cell is difficult to release.Then，industrialization development for Chlorella is restricted.Therefore，a safety and effective method to break cell is the key technology in Chlorella industry.Ultrasound technology was adopted to break Chlorella cell in this study.In order to obtain the optimum parameters of ultrasound technology，the effects of several factors including solidliquid ratio，ultrasonic power and process time on the breaking were investigated by using a single factor experiment and further optimized by using BoxBehnken experiment and response surface methodology （RSM）.The results showed that process time had the most important influence on cellbreakage and it was followed by ultrasonic power ，solidliquid radio in the effects.The optimal condition of cellbreakage was obtained，that was，solidtoliquid ratio of 1∶200，ultrasonic power of 450 W and process time of 15 min.The cell breaking rate was 79.51% under those conditions，which perfectly matched the predicted value （80%）.Therefore，it is feasible that utilizing RSM to optimize the conditions of cellbreakage.

Key words Chlorella sp.;Ultrasound wave;Cellbreakage;Response surface methodology

小球藻（Chlorella sp.）隶属于绿藻纲绿球目卵囊藻科小球藻属，是普生性真核单细胞绿藻。小球藻营光合自养，是初级生产力，处于食物链的最低端，具有分布广泛[1]、生长周期短、繁殖快等优点，成为第一种被人工养殖的微藻，在美国、日本等国已有30多年的养殖历史[2]。

小球藻营养丰富，胞内富含蛋白质、不饱和脂肪酸、色素和维生素，其中必需氨基酸、必需脂肪酸的组成全面，配比均衡，且无毒副作用，作为保健食品、水产养殖饵料、畜牧饲料添加剂得到广泛应用[3-4]。不仅如此，小球藻在污水处理[5-6]、CO2减排[7]，以及生物能源[8-9]的开发利用方面都在世界范围内引起了广泛重视。

小球藻因其结构简单、生长迅速、无毒害作用，被认为是开展生物技术研究的良好材料[10]，它可以作为生物反应器生产药物等基因工程产品[11]。但是由于小球藻细胞壁成分复杂，质地坚韧[12]，给胞内有效成分的获取造成了一定的困难，从而影响了小球藻相关产品的应用和推广 [13-14]。

为了寻找一种安全有效的破壁方法，笔者主要通过超声波破碎技术对小球藻进行破壁处理，考察了单因素料液比、超声时间和超声功率对破壁效果的影响。通过响应曲面模型对小球藻的超声波破壁工艺进行优化，旨在寻找最佳的操作条件。

1 材料与方法

1.1 材料 小球藻藻种，由烟台富生科技有限公司提供。

1.2 设备与仪器 生物显微镜（上海长方光学仪器有限公司）;分析电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司];Scientz-IID超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 單因素试验。

固定条件：超声波功率为500 W，处理时间20 min，料液比1∶200 （g∶mL），改变单一因素，考察其对小球藻细胞破碎率的影响，每组试验重复3 次，取平均值。

破碎率=[（原始细胞个数-破碎处理后剩余的细胞个数）/原始细胞个数]×100%

1.3.2 响应面法优化超声破壁技术。

根据Box-Behnken 中心组合试验设计原理，在单因素试验的基础上，选取3因素3水平试验对提取条件进行优化，试验因素和水平见表1，每组试验重复3 次，取平均值。针对得到的数据进行分析，利用Design-Expert 8.0.6 软件优化工艺条件，确定最优的料液比、超声功率、超声时间。

2 结果与分析

2.1 超声破壁影响因素确定

2.1.1 超声时间对细胞破碎率的影响。

固定料液比、超声波功率等条件，研究不同超声时间对细胞破碎率的影响。超声时间由3 min延长到15 min时破碎率从3%上升到76%，延长超声处理时间，细胞膜上会产生更多的孔洞，细胞更容易破碎，进而导致细胞破碎率增加（图1）。当超声处理时间超过15 min后，破壁率维持在75%左右，并没有明显提高，综合能耗和经济效率的角度考虑，采用超声时间15 min进行超声处理。

2.1.2 超声波功率对细胞破碎率的影响。

固定料液比、超声时间等条件，研究不同超声波功率对细胞破碎率的影响。超声波功率由300 W升到450 W时细胞破碎率由50%增加到73%（图2）。在刘圣臣等[15]的研究中也呈现同样趋势。其可能原因是由于超声波导致细胞膜表面及周围的空化气泡破裂，随着功率的增大，会产生大量的裂缝及孔洞，进而使细胞壁破碎率增大[14]。但超过400 W继续增大功率，藻细胞破壁率增加并不明显，从经济和效率方面综合考虑，采用450 W为最佳功率。

2.1.3 料液比对细胞破碎率的影响。

固定超声波功率、超声时间等条件，研究不同料液比对细胞破碎率的影响。该试验设计1∶50，1∶100，1∶200，…，1∶1 000共7个梯度，结果如图3所示。当料液比从1∶100减小到1∶1 000时，细胞破碎率先升高后下降;当料液比为1∶200时，细胞破碎率最高，达76%;料液比高于1∶200时液体中藻细胞浓度过高，细胞聚集成团影响超声破壁效果，破碎率仅有50%左右。随着水量的增加，当料液比低于1∶200之后藻细胞浓度降低，导致细胞破碎率低，因此，1∶200为超声破碎时最适合的料液比。

2.2 响应面法对超声破碎方法进行优化

根据表2 的结果，用Design-Expert 8.0.6 软件进行方差分析。从方差分析结果可知，试验所选模型极显著（P<0.01）;一次项中超声时间（A）和超声波功率（B）对细胞破碎率的影响达极显著（P<0.000 1），料液比（C）对细胞破碎率的影响为显著（P<0.05）;二次项中超声时间（A）、超声波功率（B）、料液比（C） 对细胞破碎率的影响均为极显著（P<0.01）;交互项中AB、AC 影响为显著（P<0.05），而BC 影响不显著，可以看出各因素对响应值的影响不是简单的线性关系，影响程度从大到小依次为超声时间（A）、超声波功率（B）、料液比（C）。

采用Design-Expert 8.0.6 软件对表2的数据进行回归分析，得三元二次回归方程：

Y=80.00+3.25A+1.13B-0.38C+0.25AB+0.25AC-2.75A2-1.00B2 -10.50C2

用Design-Expert 8.0.6 软件分析模型的可信度，模型的决定系数R2=0.999 6，R2adj=0.999 1，其中R2越接近1，表明模型预测的响应值越准确，可用于试验分析和预测。模型变异系数C.V.% = 0.26 < 10，变异系数反映试验的可重复性，其值越小表明试验越精确。模型信噪比Adeq Precision=19.360>4，表明模型的相应信号足够强，模型可信并可用于拟合试验结果。综上分析，该模型可用于分析预测超声波破壁技术工艺。

根据回归分析结果做响应曲面图，分析超声时间、超声波功率、料液比三者之间交互作用对细胞破碎率的影响，其响应曲面如图4～6所示。

通过Design-Expert 8.0.6 软件分析得出，小球藻破碎最佳提取条件为料液比1∶200、超声波功率为450 W、超声时间15 min，该条件下细胞破碎率最高，为80%。按最优组合方案中的提取条件进行验证试验，得到的藻细胞破碎率为（79.51±0.19）% （n=3），和预测值吻合较好，相对误差约为0.61%，表明该回归模型与验证试验结果吻合良好，回归方程能真实地反映超声时间、超声波功率、料液比对藻细胞破碎率的影响，模型工艺参数准确可靠，能较好地预测实际情况。

3 结论

该试验研究了超声波破碎藻细胞的最佳工艺，在单因素试验的基础上，通过响应面法优化了超声波破壁工艺，得到如下结论。

（1）建立了一个以小球藻破碎率为目标值，料液比、超声波功率、超声时间为因子的数学模型：Y=80.00+3.25A+1.13B-0.38C+0.25AB+0.25AC-2.75A2-1.00B2-10.50C2，采用此模型在该试验范围内能较准确地预测小球藻的破碎率。

（2）通过试验结果的方差分析可知，在该试验范围内，各因素对小球藻破碎率的影响顺序依次为超声时间、超声波功率、料液比。

（3）小球藻超声波破碎率的工艺参数为料液比1∶200、超声波功率450 W、超声时间15 min，在此优化工艺条件下，实际测得的小球藻破碎率为79.51%。

参考文献

[1]WANG W L，WU X M，TAN J，et al.Using response surface methodology optimize culture conditions for human lactoferrin production in desert Chlorella[J].Protein Expr Purif，2019，155：130-135.

[2] 邱并生.小球藻高密度培养[J].微生物学通报，2014，41（4）：802.

[3] 庄秀园，黄英明，张道敬，等.小球藻高附加值生物活性物质“小球藻热水提取物”的研究现状与展望[J].生物工程学报，2015，31（1）：24-42.

[4] 王宝贝，蔡舒琳，李丽婷，等.小球藻在食品中的应用研究进展[J].食品工业科技，2017，38（17）：341-346.

[5] PASTORE M，SANTAEUFEMIA S，BERTUCCO A，et al.Light intensity affects the mixotrophic carbon exploitation in Chlorella protothecoides：Consequences on microalgae-bacteria based wastewater treatment[J].Water Sci Technol，2018，78（8）：1762-1771.

[6]CHAMBERLIN J，HARRISON K，ZHANG W.Impact of nutrient availability on tertiary wastewater treatment by Chlorella vulgaris[J].Water Environ Res，2018，90（11）：2008-2016.

[7] ROSA G M，MORAIS M G，COSTA J A V.Fedbatch cultivation with CO2 and monoethanolamine：Influence on Chlorella fusca LEB 111 cultivation，carbon biofixation and biomolecules production[J].Bioresour Technol，2019，273：627-633.

[8] ELADEL H，ABOMOHRA A E F，BATTAH M，et al.Evaluation of Chlorella sorokiniana isolated from local municipal wastewater for dual application in nutrient removal and biodiesel production[J].Bioprocess Biosyst Eng，2018[2018-12-20].http：//www.doc88.com/p3177857109283.html.doi：10.1007/s00449-018-2046-5.

[9] SAKARIKA M，KORNAROS M.Chlorella vulgaris as a green biofuel factory：Comparison between biodiesel，biogas and combustible biomass production[J].Bioresour Technol，2019，273：237-243.

[10] TOHAMY M M，ALI M A，SHAABAN H A，et al.Production of functional spreadable processed cheese using Chlorella vulgaris[J].Acta Sci Pol Technol Aliment，2018，17（4）：347-358.

[11] GULRU O，SINEM G Y，CIGDEM S Z，et al.The influence of selenium on expression levels of the rbcL gene in Chlorella vulgaris[J].3 Biotech，2018，8（4）：189-196.

[12] ZHENG H，YIN J，GAO Z，et al.Disruption of Chlorella vulgaris cells for the release of biodieselproducing lipids：A comparison of grinding，ultrasonication，bead milling，enzymatic lysis，and microwaves [J].Applied biochemistry and biotechnology，2011，164（7）：1215-1224.

[13] PRABKARAN P，RAVINDRAN A D.A comparative study on effective cell disruption methods for lipid extraction from microalgae [J].Letters in applied microbiology，2011，53（2）：150-154.

[14] 章瑩颖，邓春芳，崔岩，等.不同方法对微藻细胞破碎及油脂提取效果的影响[J].中国油脂，2016，41（3）：61-65.

[15] 刘圣臣，邹宁，吴电云，等.小球藻海藻油提取中不同破壁方法的研究[J].中国食品添加剂，2009（5）：100-102.