施肥措施对华北潮土区小麦-玉米轮作体系土壤微生物群落特征的影响

张婷，孔云, ，修伟明, *，李刚*，赵建宁，杨殿林，张贵龙，王丽丽

1. 农业农村部环境保护科研监测所/农业农村部产地环境质量重点实验室/天津市农业环境与农产品安全重点实验室/天津市农田生态与环境修复技术工程中心，天津300191；

2. 沈阳农业大学植物保护学院，辽宁 沈阳 110866

土壤微生物是土壤生物中最重要的组成部分，在土壤营养元素循环、土壤肥力形成和发展、生态环境改善、植物生长和土传病害防治等许多方面产生正面或负面的相互作用（徐万里等，2015；Mulvaney et al.，2009）。土壤微生物能够灵敏地反映土壤生态环境的变化，已被广泛用于指示土壤质量变化和探究不同土地利用方式对土壤特征的影响（Kevin et al.，2016）。土壤微生物对不同施肥措施的响应和反馈对于评价科学施肥具有十分重要的意义（林先贵等，2016）。

化肥与有机肥、秸秆配合施用是解决当前中国农业生产中化肥过度使用行之有效的方法，是调节土壤养分平衡，实现土地用养结合，提高土壤肥力的重要手段。秸秆富含有机物质和氮、磷、钾等营养元素（王青霞等，2019），秸秆还田在土壤中的腐解过程会对土壤酶活性、土壤微生物群落产生一定的影响（Chen et al.，2017）。生物有机肥是一类兼具有机肥和微生物功效的肥料，含有多种营养成分和有利于提高土壤肥力、促进作物吸收和元素释放等特定功能的微生物（王喜艳，2018）。秸秆还田的基础上配施生物有机肥，在保证土壤肥力的同时促进秸秆腐熟，且短期内对土壤微生物群落以及土壤理化性质的影响显著（公华锐等，2019）。已有研究表明，施肥可使农田土壤微生物群落结构和功能发生改变，在长期施肥的条件下显著影响土壤微生物的丰度、多样性和活性（Tamilselvi et al.，2015；Chinnadurai et al.，2014）。施用有机肥能显著改变微生物的群落结构及多样性，提高微生物的生物量和代谢活性（Berthrong et al.，2013）。秸秆还田配施有机肥或微生物有机肥能合理调节土壤水氮环境，显著提高土壤微生物的数量与活性，有利于土壤生态环境的改善，其中秸秆还田配施微生物有机肥效果最为显著（公华锐等，2019）。生物有机肥的施入改变了土壤微生物群落结构及其对各类碳源的利用，可提高微生物碳源利用率、物种多样性和丰富度，与之相比，常规施肥下土壤微生物群落结构变化不显著（孙薇等，2013）。因此，在自然生态系统和农业生态系统中土壤微生物经常被用作早期生态胁迫的敏感指标，也被用于监测土壤质量的变化（Kevin et al.，2016）。

华北平原是中国粮食主产区之一，其土壤肥力高低关系到小麦、玉米等粮食作物高产与否，因此如何提升土壤肥力增加粮食产量成为农业发展的重中之重（李芳等，2015）。目前，不同施肥措施和秸秆还田对土壤微生物的影响已有一些研究（Souza et al.，2015；刘振香等，2015；李秀英等，2005；朱海平等，2003），但对于潮土区轮作体系下采用生物有机肥、化肥和秸秆三者配合施用对土壤微生物群落影响的研究还相对较少。为了保持华北地区农田地力的可持续性，研究轮作体系下不同肥料配施对土壤肥力及微生物生态系统的潜在影响至关重要。因此，本研究以华北潮土区小麦-玉米轮作系统为研究对象，采用 Biolog-ECO技术测定土壤微生物群落代谢特征，通过明确不同施肥措施下的土壤微生物群落结构和活性差异，以期更好地调控农田生态系统，提升该地区土壤肥力。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验地位于天津市宁河区试验示范基地（117°71′E，39°48′N），属温带大陆性季风气候，年均气温11.2 ℃，年均降水量642 mm，无霜期210 d。于 2015年开始设置生物有机肥、化肥和秸秆配施处理。供试土壤为盐化潮土，是华北耕作区典型性和代表性的土壤类型，耕作方式为冬小麦-夏玉米轮作。试验前供试土壤的基本理化性质为：pH 7.28，全氮 1.02 g·kg-1，全磷 0.80 g·kg-1，碱解氮 61.63 mg·kg-1，速效磷 79.90 mg·kg-1，有机质 17.85 g·kg-1（侯萌瑶，2017）。

1.2 试验设计

试验共设置5个施肥处理（表1），以T1（单施化肥）为对照，其他处理分别为：T2（50%氮肥与生物有机肥配施）、T3（常量化肥与生物有机肥配施）、T4（常量化肥与秸秆配施）和 T5（常量化肥－生物有机肥与秸秆配施）。每个处理3次重复，共15个小区，小区面积为15 m×24 m。试验中使用的肥料为尿素（N，46%）、磷肥（P2O5，18%）、钾肥（氧化钾，30%）、复合肥（N，20%；P，21%；K，7%）、生物有机肥（NPK 总养分 8%，有机质含量20%，有效活菌密度≥0.2×108/g）（馕播王牌），江阴市联业生物科技有限公司生产。在种植前进行玉米秸秆按比例粉碎还田，小麦秸秆全部还田，生物有机肥全部作为基肥施用，纯氮量 60%化肥作为基肥施用，纯氮量40%化肥在小麦苗期作为追肥施入。

1.3 土壤样品采集

夏季小麦收割前（2017年6月中旬）在各处理样地中采集土壤样品，采样时去除表层的枯枝落叶。采用S形采样法，随机选取12点采样，每个处理重复3次，采集0-20 cm深度的土壤样品。同一处理每一重复土壤充分混匀形成一个混合样品，剔除石砾和植物残体等杂质，装入无菌封口袋置于冰盒中迅速带回实验室，放入4 ℃冰箱保存，并在7 d内进行Biolog-ECO微平板分析。其余部分土壤样品风干后，用于土壤基本理化性质的测定。

表1 不同处理肥料施用量Table 1 The amount of fertilizer applied in different treatments

1.4 测定方法

1.4.1 土壤理化性质的测定

土壤pH值使用MP511型pH计测定，水土比2.5∶1；土壤有机质测定采用重铬酸钾-浓硫酸外加热氧化法测定；土壤速效磷测定采用碳酸氢钠-钼锑抗比色法；土壤全氮使用流动分析仪测定。具体步骤参照《土壤农化学分析》（鲍士旦，2000）。

1.4.2 土壤微生物功能多样性测定

土壤微生物的生理代谢图谱（Community Level Physiological Profiling，CLPP）使用Biolog-ECO微平板并结合 Biolog微生物自动分析仪（Biolog，Hayward，CA，USA）测定，具体步骤参见Garland et al.（1991）的测定方法并略有变动。

1.5 数据处理与分析

土壤微生物群落整体代谢活性采用平均颜色变化率（AWCD）表征，多样性采用Shannon指数（H′）、Pielou均匀度指数（E）、Simpson指数（D）和 McIntosh指数（U）和丰富度指数（S）表征，计算公式如下：

式中，Ai为第i孔在590 nm处的吸光度值；A0为对照孔在590 nm处的吸光度值；Bi为第i孔在750 nm处的吸光度值；B0为对照孔在750 nm处的吸光度值；n为培养基碳源的种类数，本研究中 n值为31。

式中，Pi为第i孔的相对吸光值与整个微平板相对吸光值总和的比值，即Pi=C(590-750)/∑C(590-750)。

式中，S为丰富度指数；H为Shannon多样性指数。

式中，Pi为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比值。

式中，ni是第i孔的相对吸光值。

运用 Microsoft Excel 2010软件进行数据整理；运用SPSS 17.0软件进行One-way ANOVA的Duncan多重比较方法及Data Reduction工具进行差异显著性分析（P＜0.05）和主成分分析（Principle component analysis，PCA）；采用Origin 9.1软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对土壤理化性质的影响

不同施肥方式对土壤化学性质的影响不同（表2）。T1与T5处理的土壤有机质、全氮、全磷和速效磷含量具有明显差异（P＜0.05），且T5处理的相关数值均高于其他处理。T1处理的土壤pH值显著高于T2与T5处理（P＜0.05）。T2与T3处理相比，化肥减量降低了土壤 pH、土壤有机质、全氮和全磷含量，提高了土壤速效磷的含量，这可能是化肥减量处理年限较短，土壤速效养分对施肥变化较敏感。由此说明，与单施化肥相比，化肥-生物有机肥与秸秆配施降低了土壤pH值，增加了土壤有机质、速效磷、全氮和全磷含量，提升了土壤肥力。

表2 不同施肥处理对土壤理化性质的影响Table 2 Effect of different fertilization treatments on soil physical and chemical characters

2.2 土壤微生物群落平均颜色变化率

平均颜色变化率（AWCD）表征土壤微生物群落对底物不同碳源利用强度的指标，反映了土壤微生物的代谢活性、微生物群落生理功能的多样性（Zabinski et al.，1997）。培养开始后连续7 d每隔24 h测AWCD变化（图1）。随着培养时间的延长，土壤微生物对碳源的利用量也逐渐增加。培养24 h前AWCD增长率变化不明显，而培养24 h后AWCD值呈现快速增长的趋势（除T3外），此阶段微生物代谢活性最高，对不同碳源的利用能力最强。培养120 h时各处理AWCD在0.72-0.94之间，其变化表现为 T5＞T4＞T2＞T1＞T3，显著性分析表明，T5和T4的AWCD值显著高于T3（P＜0.05），但其他各处理之间（除T3外）差异不明显（P＞0.05）。T3处理AWCD低于T1和T2处理，但差异不显著，说明化肥与生物有机肥配施时，氮肥减量施用有助于提高土壤微生物对碳源的利用率。从整体趋势上看，配施秸秆的处理土壤微生物 AWCD值升高速率更快，表明化肥、生物有机肥和秸秆三者配施改善了土壤微生物群落的活性，有助于提高土壤微生物利用碳源的能力。

图1 土壤微生物群落AWCD随培养时间的变化Fig. 1 AWCD changes with incubation time of different treatments

表3 土壤微生物群落功能多样性指数Table 3 Diversity indices for soil microbial communities

2.3 土壤微生物群落功能多样性

为进一步明确施肥措施对土壤微生物群落的影响，本研究对培养120 h的数据进行土壤微生物群落功能多样性分析。Pielou均匀度指数（E）和Simpson指数（D）在各处理之间差异不显著（P＞0.05）（表3）。各施肥处理中T5的土壤微生物5种功能多样性指数的值均最高，其Shannon指数（H′）显著高于 T1 和 T3（P＜0.05），丰富度指数（S）显著高于其他各处理（P＜0.05）。以上结果表明，化肥-生物有机肥与秸秆配施能够提高土壤微生物的多样性、均匀度和丰富度，有利于维持土壤微生物群落代谢活性和功能多样性。

不同施肥处理下，土壤微生物群落功能多样性对土壤化学性质的响应不同（表4）。土壤全氮和全磷的变化对各处理下的土壤微生物群落功能没有显著影响。Shannon指数（H′）和Simpson指数（D）与土壤pH呈显著负相关性；丰富度指数（S）与土壤有机质含量呈显著正相关性；Shannon指数（H′）与土壤速效磷呈显著正相关性。表明土壤微生物群落的多样性与丰富度受土壤pH、有机质、速效磷含量的影响较大，在一定程度上增加土壤有机质和速效磷含量有利于提升土壤微生物群落功能多样性。

表4 土壤微生物群落功能多样性指数与土壤化学指标的相关关系Table 4 Correlation between the diversity indices of soil microbial communities and chemical indexes

2.4 不同施肥处理土壤微生物碳源利用特征

土壤微生物对Biolog-ECO微平板上的6大类碳源利用特征受到微生物群落组成的影响（刘晶鑫等，2015）。不同施肥处理对各类碳源相对利用率最高的均是糖类，占总碳源利用率的 45.34%-47.74%；氨基酸类次之，占 18.08%-22.48%；对羧酸类、聚合物类、胺类和酚酸类的相对利用率较低，分别占 10.83%-17.21%、4.87%-14.35%、4.44%-6.29%和1.41%-3.79%（图2）。土壤微生物对糖类、酚酸类和胺类的碳源相对利用率在各处理之间差异不显著（P＞0.05）。T3处理土壤微生物对糖类、羧酸类、胺类和氨基酸类碳源的利用能力最高；T2处理土壤微生物对聚合物类碳源的利用能力较高；T4和T5处理土壤微生物对酚酸类碳源的利用能力最高。这表明施肥方式的变化改变了土壤微生物对碳源利用的偏好，从而改变了土壤微生物群落的代谢功能。

图2 不同施肥处理土壤微生物对6类碳源的利用Fig. 2 Utilization on six groups of carbon sources by soil microbe under different fertilizations

2.5 不同施肥处理土壤微生物群落碳代谢的主成分分析

Biolog的主成分分析通过降维的方法，用少数新的相互无关的变量来表示原始数据中大部分的信息，降维后的主元向量空间中可以用点的位置直观地反映出不同微生物群落的代谢特征，是反映土壤微生物群落结构特征的有效手段（马艳等，2006）。本研究共提取了10个主成分，累计方差贡献率达92.59%。由于第3-10主成分贡献率均小于10%，所以只对第1主成分和第2主成分分析土壤微生物群落的代谢特征。位于同一象限的各处理在第1、2主成分得分值离散较小，没有显著性差异，说明这些处理的土壤微生物碳代谢功能群结构相似；位于不同象限的各处理在第 1、2主成分得分值差异较大，说明不同处理土壤微生物碳代谢功能群结构存在较大差异（赵兰凤等，2017）。T1、T3位于PC2正端，T4、T5位于PC1正端，表明T1与T3处理、T4与T5处理的土壤微生物对碳源的利用方式比较接近，且两组处理之间土壤微生物碳源利用能力在PC轴上差异显著（图3）。在各处理受PC轴主要碳源的影响中，T5处理受PC1上的主要碳源影响较大，其他处理则同时受到PC1和PC2上主要碳源的影响。可见，不同施肥处理在PC轴上出现了明显的分布差异，表现出土壤微生物群落的不稳定性，即不同施肥处理对微生物的碳源利用类型有显著影响。

初始载荷因子反映主成分与碳源利用的相关系数，载荷因子越高，表示该碳源对主成分的影响越大（张瑞等，2013）。进一步分析 31种碳源在PC1、PC2上的载荷值可知（表5），以|r|＞0.6计，与第1主成分（PC1）具有较高相关性的碳源有9个，主要包括糖类（6个）、氨基酸类（2个）和聚合物类（1个），而与第2主成分（PC2）具有较高相关性的碳源有2个，主要包括糖类（1个）和胺类（1个）。

表5 不同碳源种类在PC1和PC2上的载荷值Table 5 Correlation analysis of different carbon source utilization with PC1 and PC2

综上所述，在PC1上，T5处理土壤微生物对β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖、D-甘露醇、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-纤维二糖、α-D-乳糖、L-天门冬酰胺、L-苏氨酸和吐温80的利用能力较强。

3 讨论

微生物群落在土壤中处在一个动态平衡的过程中，土壤理化因子的变化会影响土壤微生物群落的平衡，从而影响土壤微生物的活性及其生态功能，进而影响土壤肥力和环境质量（Garland et al.，1991）。有机物料大都含有丰富的微生物所需的碳源、氮源，土壤中加入有机物料能够提高有机质含量及微生物群落多样性（孔维栋等，2004）。从本研究结果来看，不同施肥处理下的土壤理化性质发生了显著变化，总体趋势为：化肥-生物有机肥和秸秆配施＞化肥-生物有机肥配施＞化肥-秸秆配施＞单施化肥，化肥-生物有机肥和秸秆配施处理的土壤有机质、全氮、速效磷和全磷养分含量明显高于其他处理。与单施化肥相比，生物有机肥与秸秆配施降低了土壤pH值。相关性分析表明，土壤微生物群落的多样性与丰富度受土壤 pH、有机质、速效磷含量的影响较大，在一定程度上增加土壤有机质和速效磷含量有利于提升土壤微生物群落功能多样性。这可能是由于秸秆还田后，秸秆附近微生物大量繁殖，形成土壤微生物活动层，加速秸秆中有机态养分的释放，从而提高土壤有机质含量（王应等，2007）。前人研究表明，配施有机肥能够显著提高土壤有机质、速效磷、速效钾和碱解氮的含量，氮肥的施入会降低根际土壤的 pH值（张恩平等，2018）。秸秆还田后能有效提高土壤有机碳、全氮含量，改善土壤理化性状（刘继明等，2013）。因此在实际生产中，可通过合理增施有机肥或秸秆与化肥配施来改善土壤理化性质。

平均颜色变化率（AWCD）能够反映不同施肥处理下土壤微生物利用碳源的能力，可以根据AWCD值的高低来判断微生物利用碳源能力的强弱（Benizri et al.，2005）。本研究中，不同施肥处理的 AWCD随土壤微生物的生长时期逐渐升高，说明随着时间的延长土壤微生物对碳源的利用能力在不断提高。化肥-生物有机肥与秸秆配施处理的AWCD值高于其他处理，表明增施秸秆或生物有机肥能显著提高农田土壤微生物的碳源利用率。分析认为秸秆还田后降解或有机肥施用增加了土壤有机质含量，使土壤中可利用的碳源种类增多，改变了土壤微生物生境，提高了土壤微生物的繁殖能力，增强了土壤微生物群落的代谢功能。在玉米秸秆还田方式中，发现全量秸秆还田显著增加了土壤微生物生物量，一年两次秸秆还田使土壤微生物生物量增加，且小麦季土壤微生物生物量显著高于玉米季（强学彩等，2004）。与低量有机肥相比，中、高量有机肥处理提高了稻田土壤微生物的碳源利用率和微生物群落功能多样性，土壤微生物碳源利用的类型因不同施肥处理而产生差异（郝晓晖等，2010）。

不同施肥处理下土壤微生物群落在各指数之间的值均不相同，其中化肥-生物有机肥与秸秆配施处理的均匀度指数（E）、McIntosh指数（U）和丰富度指数（S）显著高于其他处理，说明该施肥方式能够提高土壤微生物群落功能多样性。这可能是由于生物有机肥中各种功能菌能够改变土壤微生物区系，在植物根系生态系统中形成优势菌群，并且抑制其他有害微生物的繁殖（杨丽等，2017）。秸秆降解后的植物纤维使土壤的质地疏松，增加了土壤含氧量，加之配施生物有机肥使土壤形成了有利于微生物生存繁殖的环境，提高了土壤微生物的代谢强度。秸秆还田后经土壤微生物的矿化作用能够释放碳、氮、磷、钾等营养元素，这些元素是土壤养分的重要补充（梁银丽等，2001）。秸秆是土壤微生物利用的有效能源，秸秆中含有大量易分解的有机物质，容易被微生物利用，添加这类物质可以促进土壤微生物增殖（Mubarak et al.，2003）。土壤中细菌、放线菌和真菌数量随有机-无机肥配施比例的增加而增加，而在单施无机复合肥下微生物数量增加不明显，中量有机-无机肥配施较单纯施中量无机肥可显著提高微生物数量（王才斌等，2013）。本研究结果与邢鹏飞等（2016）研究结果一致，他们发现秸秆还田+腐熟剂+常规施肥及有机肥替代部分氮磷钾肥显著提高了土壤微生物物种丰富度指数和均匀度指数，增强了微生物代谢活性，提高了土壤微生物群落功能多样性。

Biolog-ECO板含有31中碳源，根据其不同的官能团可分为6大类（Insam et al.，1997），其中糖类7种、羧酸类9种、氨基酸类6种、聚合物类4种、酚酸类3种、胺类2种。本研究中土壤微生物群落对糖类、羧酸类和氨基酸类碳源的利用率均明显高于其他3种碳源，分别占总碳源相对利用率的45.34%-47.74%、10.83%-17.21%和 18.08%-22.48%。主成分分析进一步解释了不同施肥处理下小麦-玉米轮作体系土壤微生物碳源利用之间的差异。主成分分析表明，不同施肥处理在PC轴上出现了较大分异，说明了微生物群落的不稳定性，不同施肥处理对微生物的碳源利用类型有显著影响。对PC1贡献较大的碳源主要是糖类，而对PC2贡献较大的碳源主要是糖类和胺类。徐一兰等（2017）认为施用有机肥和秸秆还田使微生物可以利用的碳源趋于稳定，促进偏好氨基酸类和单糖糖类物质为碳源的微生物群落发育，从而增加了有机-无机肥配施处理稻田土壤中利用氨基酸类和单糖糖类物质根际土壤微生物群落数量。

综上所述，施肥处理会对土壤微生物群落多样性产生不同程度的影响。本研究中常量化肥-生物有机肥与秸秆配施增强了微生物代谢活性，显著提高了土壤微生物功能多样性。本研究结果为华北地区小麦-玉米轮作体系下优化施肥方式、维持土壤微生态、改善土壤环境和提高土壤肥力提供一定的参考依据。常量化肥-生物有机肥与秸秆配施是否为最佳施肥方式，改变各种肥料配比能否达到更佳的效果，仅从土壤微生物的变化特征研究还远远不够，有待进一步深入研究。

4 结论

（1）本试验中土壤微生物对不同碳源的相对利用率随不同施肥处理的变化而不同，常量化肥-生物有机肥与秸秆（氮肥200 kg·hm-2；生物有机肥3000 kg·hm-2；秸秆全量还田）配施有利于土壤微生物代谢活性，有助于提高土壤微生物群落碳源利用能力。

（2）本试验中常量化肥-生物有机肥与秸秆（氮肥 200 kg·hm-2；生物有机肥 3000 kg·hm-2；秸秆全量还田）配施提高了土壤微生物的多样性和丰富度，有利于维持土壤微生物群落代谢活性和功能多样性。

（3）土壤微生物群落代谢特征随施肥措施变化而发生改变，其中常量化肥与秸秆配施和常量化肥-生物有机肥与秸秆配施的土壤微生物群落代谢特征较为相似，而与其他处理间土壤微生物群落代谢特征显著不同。