橡胶籽苗茎腐病原菌鉴定

蒋桂芝，田 海，陶建祥

（1.云南省热带作物科学研究所，云南景洪666100；2.云南天然橡胶产业集团江城有限公司，云南普洱665907）

目前橡胶树种苗繁育主要采用籽苗芽接的方法，育苗期比过去的实生苗芽接缩短1年左右。2018年6月，云南景洪橡胶育苗大棚橡胶树籽苗出现茎腐病：茎病部变黑、坏死还有凝胶，与疫霉（Phytophthorade Bary)引起的橡胶树季风性落叶病叶柄症状极为相似（图1a）。为准确识别和防治病害，笔者进行了病原分离鉴定，现将鉴定结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

病原材料：采自云南省热带作物科学研究所橡胶研究中心育苗大棚内的籽苗病茎。

PDA培养基：土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂17 g，水 1 000 mL。

琼脂培养基：琼脂17 g，水1 000 mL。

皮氏培养液：Ca（NO3）20.4 g，KH2PO40.15 g，Mg（NO3）20.15 g，CaCl 0.06 g，蒸馏水 1 000 mL。

图1 植株田间感病症状、接种症状

试验接种材料：由云南省热带作物科学研究所橡胶研究中心提供，为培育10个月生长正常的云研77-4籽苗。

1.2 方法

1.2.1 病原分离

切取长度为5 cm左右的感病组织，经75%酒精表面消毒后，用灭菌刀片切取大小（3～5）mm×（3～5）mm病健交界组织，置于PDA平板上，在25℃室温下培养3 d。长出菌落后，用灭菌针挑取少量菌丝置于另一个PDA平板上，在25℃室温下培养5 d形成菌落，再从中挑取少量菌丝置于琼脂平板上，在25℃室温下培养36 h，显微镜下进行单菌丝分离，在25℃室温下培养5 d得到纯培养菌，用于致病性测试和形态鉴定。

1.2.2 致病性测试

培养好的菌种用灭菌刀片划成大小约5 mm×5 mm的菌块备用。将准备好接种的橡胶籽苗茎干用自来水清洗1次，待茎干上的水分干后，用大头针在茎干上扎3个小孔，品字排列，孔距3～5 mm，然后将备好的菌块有菌丝的一面贴在小孔上，用无菌湿棉保湿2 d，5～7 d后观察接种点感病情况。当接种点出现与田间一致的感病症状后再进行病原分离，得到与接种菌一致的菌即确认为病原菌。

1.2.3 病原鉴定

根据菌落和孢子囊的形态特征、适宜温度，并参照《疫霉菌及其研究技术》等资料进行鉴定。

1.2.3.1 菌落形态

将纯培养菌转接到新PDA平板上，在25℃室温、自然光照条件下培养5 d，观察菌落形态。

1.2.3.2 厚垣孢子形成

将接有病原菌的PDA平板置于25℃、室内RH65%、自然光照下培养10～15 d，观察原垣孢子的形成。

1.2.3.3 孢子囊形成

将凹面玻片用75%的酒精表面消毒，凉干备用。用灭菌针挑取大小（2～3）mm×（2～3）mm的菌块置于玻片的凹面中，在凹面中加入约3 mL的皮氏培养液，将载有菌块的玻片置于28℃、自然光照下在培养缸保湿培养1～2 d，观察孢子囊的形成及形态特征。

1.2.3.4 适宜生长温度测试

将纯培养菌株扩繁后，用灭菌打孔器打成直径5 mm的菌丝块，将菌丝块接种在PDA平板上，接种好的PDA 平板分别置于温度为 5、10、15、20、25、30、33、37℃，RH 80%的培养箱中培养5 d，每个处理5皿。5 d后用数显卡尺测量菌落生长直径，依据各处理菌落生长量确定病原菌的适宜温度。

2 结果与分析

2.1 病原分离

分离样本8个，均得到形态一致的白色菌落，用灭菌针挑取菌丝镜检，确定所得菌落均为同一真菌。选取1个菌落为代表菌进行单菌丝分离培养，得到纯培养菌，编号为XJZM20180627，用于致病性测试和病原鉴定。

2.2 致病性测试

籽苗茎上接种5 d后，在接种部位均出现与田间感病一致的症状（图1b），经病原的再分离得到与接种菌一致的菌，确认为病原菌。

2.3 病原鉴定

2.3.1 菌落形态

PDA平板上的气生菌丝生长旺盛，菌落白色（图2a、图2b），菌丝无色，粗细均匀，菌丝无隔，宽度4.1～5.2 μm。菌丝未见膨大。

图2 X J Z M 2 0 1 8 0 6 2 7菌落形态、孢子囊和孢子囊梗、厚垣孢子

2.3.2 厚垣孢子形成

在25℃、室内RH65%、自然光照下培养10 d，镜检观察到有厚垣孢子形成，厚垣孢子球形、近球形，顶生或间生，直径25～38 μm（图2c）。

2.3.3 孢子囊形态特征

在25℃、皮氏培养液中培养24 h产生孢子囊。孢子囊梗简单合轴分枝，粗2.5～5.2 μm；孢子囊多为梨形、卵形、近圆形，少数椭圆形，大小（33～58）μm×（30～40）μm，长宽比 1.1～1.9。孢子囊脱落，具短柄，柄长1.5～4.3 μm。孢子囊乳突突起明显，单乳突，偶见双乳突（图2d）。

2.3.4 适宜生长温度测试

在 5、10、15、20、25、30、33、37℃，RH 80%培养箱中培养5 d，得到不同温度菌丝生长曲线（图3），可以看出，菌丝生长范围为10～33℃，适宜生长温度15～30℃，最适生长温度为20～25℃，最高生长温度＜33℃。

图1 不同温度下菌丝生长曲线

根据菌落、孢子囊形态及橡胶籽苗上的病状，比较郑小波［1］、余永年等［2］的文献描述，鉴定该病原菌为棕榈疫霉Phytophthora palmivoraButler。

3 小结

棕榈疫霉P.palmivora是在热区广泛分布的疫霉种，能引起橡胶树［3］及多种热带作物重要病害［4-6］。充分的高湿环境是疫霉病发生和流行的必要条件，橡胶籽苗大棚栽培就具备这样的条件。因此，本病的防治应注意：1）适时调整、降低大棚内的水分和相对湿度；2）及时清除病苗；3）必要时对病区籽苗可喷雾甲霜灵、甲霜·霜霉威、疫霉净等农药，能有效控制本病的发生。