串联体结合血糖仪的便携式传感器检测cfDNA

周津，王代芳，钟碧萍

（福建生物工程职业技术学院，福建福州 350002）

游离DNA（cfDNA）作为血液及体液中的肿瘤标志物，对癌症患者的早期诊断具有较高的应用价值[1-2]。常规的cfDNA检测方法[3-6]有放射性免疫分析法、聚合酶链反应法、酶联免疫吸附法、实时荧光定量PCR等，但这些方法有的检测成本较高，有的方法复杂且需要特殊仪器，不适合大规模人群的初筛。DNA利用自组装形成串联体作为信号放大机制被广泛关注[7-9]。血糖仪具有体积小便携、检测成本低、定量准确、操作简便等优点，是最成功的便携式仪器[10]。本文以DNA串联体作为信号放大系统，血糖仪作为检测器，构建一种快速筛查肿瘤标志物cfDNA的便携式传感器。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

蔗糖（阿尔法埃莎中国有限公司）；Sulfo-SMCC，TCEP，蔗糖转化酶和吐温-20（西格玛奥德里奇贸易有限公司）；磷酸二氢钠和磷酸氢二钠（分析纯，上海化学试剂公司）；链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子(SA-PMPs)（美国普洛麦格公司）。

DNA均由上海生工生物技术有限公司合成及纯化（中国上海），序列如下（从左到右:5’到3’）:

3’-生物素修饰的捕获DNA:TGCAGCTCATGCC AAAAAAAAA- Biotin

目标DNA:GGCATGAGCTGCATGATGAGCTG

3’-巯基修饰的信号DNA:TACTCCCCCAGGTGCC AGCTCATCA- SH

附加探针AP:GCACCTGGGGGAGTATGATGAGCTG

本实验用水为18.2 MΩ的超纯水，所用缓冲溶液配制如下:（1）缓冲溶液A:0.1 M氯化钠，pH为7.4的0.1 M磷酸盐缓冲溶液， 0.05%的吐温-20。（2）缓冲溶液B:0.1 M氯化钠，pH为7.4的0.1 M磷酸盐缓冲溶液。（3）1.0 M的蔗糖溶液用缓冲溶液A（pH=7.4）配制并储存于4 ℃待用。

Milli-Q超纯水系统（Millipore，Bedford，USA）；PHS-3C型精密酸度计（上海大普仪器有限公司）；FINNPIPETTE 可调式移液器（上海热电仪器有限公司）；TGL-16 型台式高速冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；罗氏罗康全血糖仪及其配套试纸Roche ACCU-CHEK®Active罗氏罗康全活力 2 型（德国罗氏诊断产品有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 捕获探针（CP-PMPs）的制备

（1）移取0.6 mL浓度为1 mg/mL的修饰有链霉亲和素的磁珠（SA-PMPs），用缓冲溶液B洗涤3次后重新溶解于0.6 mL的缓冲溶液B中。加入生物素修饰的捕获DNA并将混合物置于摇床上室温振荡1 h。（2）用缓冲溶液B洗涤磁珠3次并溶解于适量缓冲溶液B中，即配制成终浓度为20 μM的捕获探针母液（CP-PMPs）。由于链霉亲和素和生物素之间具有强亲和力的特异性结合作用[11]，因此修饰有生物素的捕获DNA能被固定结合在修饰有链霉亲和素的磁珠SA-PMPs表面。（3）用磁铁吸附混合溶液中捕获DNA与SA-PMPs反应所生成的磁珠复合物，并进一步用缓冲溶液B洗涤此磁珠复合物3次。（4）将洗涤后的磁珠复合物重新分散于缓冲溶液B中并储存于4 ℃待用。

1.2.2 信号探针（SP-酶）的制备

根据文献报道的方法[12]合成蔗糖转化酶标记的信号探针（SP-invertase）。制备步骤简述如下:首先移取30 μL浓度为100 μM的巯基修饰的信号DNA溶解于超纯水中，再加入2 μL浓度为3 mM的TCEP和 20 μL pH=5.5、浓度为 10 mM 磷酸盐缓冲溶液，将混合溶液在室温下反应1 h。最后，将反应混合物用缓冲溶液A透析得到活化后巯基修饰的信号DNA。为了使蔗糖转化酶共价键接到信号DNA上，移取800 μL浓度为10 mg/mL的蔗糖转化酶溶液并称取1 mg的Sulfo-SMCC同时加入到缓冲溶液B中，将其混合并涡旋5 min后，将混合物置于摇床上在室温下振荡1 h。随后用离心机进行离心分离，除去未溶解的Sulfo-SMCC。取上清液中用Sulfo-SMCC修饰后的蔗糖转化酶溶液与上述活化后的信号DNA在室温下混合孵化48 h。为了移去未反应的信号DNA，将混合溶液用缓冲溶液A透析即得到纯化后的信号探针（SP-invertase）。

1.2.3 目标物的检测

取适量信号探针（SP-invertase）、捕获探针（CP-PMPs）和附加探针（AP）加入缓冲溶液B（pH=7.4）中，配成捕获探针、信号探针和附加探针终浓度为4 μM、总体积为30 μL的测试溶液。在体系中，附加探针与信号探针首先自组装形成长串的蔗糖转化酶标记的DNA串联体，在没有目标DNA存在的条件下，串联体不能结合到磁珠上，所检测到的血糖仪信号极低，同时可以观察到血糖试纸背面的比色窗口颜色没有明显的变化。当体系中加入不同浓度的目标DNA并在黑暗室温条件下孵化1.5 h后，目标DNA与信号探针与捕获探针之间发生强有力的亲和作用，形成具有稳定的互补配对结构。随后，用磁铁分离出体系中的磁珠-蔗糖转化酶串联体复合物。使用50 μL缓冲溶液B进一步洗涤固定在磁珠表面的蔗糖转化酶串联体复合物3次，并将其最终溶解于10 μL的缓冲溶液B中。然后，向上述溶液中小心加入20 μL浓度为1.0 M的蔗糖溶液，并在45 ℃下孵化20 min。此时，蔗糖转化酶催化蔗糖水解生成葡萄糖并能被血糖仪检测到。需要注意的是，在到达20 min时立即将测试溶液置于100 ℃水浴锅中灭活。采集在加入目标DNA前后血糖仪信号的变化数据用于定量分析。

2 结果与讨论

2.1 反应时间对血糖仪信号增强值ΔS的影响

考察了探针与目标DNA的特异性结合时间（0～3 h）对血糖仪信号增强值ΔS的影响，结果如图1所示。当反应1.5 h之后体系的ΔS趋于稳定，故本实验选取反应时间为1.5 h。

图1 两种探针与目标DNA特异性结合时间对血糖仪信号增强值的影响

2.2 反应温度对血糖仪信号增强值ΔS的影响

考察了酶催化反应温度（25～60 ℃）对血糖仪信号增强值ΔS的影响，结果如图2所示。当酶催化反应温度低于45 ℃时，酶催化效果随温度上升而增强，并在45 ℃时达到最佳酶催效果；在超过45 ℃后，酶催化效果大幅下降，说明高温可能会使酶部分失活，不利于酶催化反应的进行。故本实验选择反应温度为 45 ℃。

图2 蔗糖转化酶催化蔗糖水解反应温度对血糖仪信号增强值的影响

2.3 探针浓度对血糖仪信号增强值ΔS的影响

考察了0～6.0 μM探针的反应浓度对血糖仪信号增强值ΔS的影响，结果如图3所示。我们选择探针浓度分别为1.0μM，2.0μM，3.0μM，4.0μM，5.0μM，6.0μM，由血糖仪信号增强值可知，随着浓度的增加其响应值也逐渐增大，在4.0-6.0μM范围内，响应值趋于平缓，由此选择4.0μM的探针浓度。

图3 探针浓度对血糖仪信号增强值ΔS的影响

2.4 校准曲线

在选定实验条件下，在1～316 fM的范围内，血糖仪信号增强值ΔS与目标DNA浓度的对数值呈良好的线性关系，回归方程为ΔS=3.7859lgC+8.6332，相关系数为0.9986，检出限可达1fM（图4），低于很多文献报导的方法。选择目标DNA浓度为100 fM时，重复制备五组传感器进行平行实验得到的相对标准偏差（RSD）为3.1%。表明该传感器具有良好的重现性。

图4 目标DNA浓度的对数值与血糖仪信号的增强值间的校正曲线

3 结论

cfDNA作为肿瘤标志物引起了广泛的关注与研究，本实验构建了一种基于血糖仪的便携式传感器，利用DNA串联体构建信号放大系统，实现对低浓度cfDNA的快速检测，为癌症的早期筛查与检测提供了一种新方法。