西藏羊肚菌水提物的抗氧化活性研究

杨小斌，曾荣华，邓颖诗，魏星，许文东，袁诚，关伟键，王浩

（1.中药提取分离过程现代化国家工程研究中心 广州白云山汉方现代药业有限公司，广东广州 510240；2.西藏林芝广药发展有限公司 中药提取分离过程现代化国家工程研究中心藏药分中心，西藏波密 850300）

羊肚菌（Morchella esculenta）在我国主产于西藏、甘肃、湖南、青海、云南、新疆、四川、山西等地[1]。近几年，有关羊肚菌的研究内容主要涉及地理环境、资源分布、生长周期、人工栽培、功能、药理作用以及产品开发等方面[2]。

羊肚菌含粗蛋白20%、粗脂肪26%、碳水化合物38.1%，还含有多种氨基酸、黄酮、色素、多糖、皂甙类等成分[3-4]，是一种珍稀的食药两用真菌，属高级营养滋补品。罗霞等[5]研究指出，尖顶羊肚菌菌丝体水提液能增加胃黏液分泌，并且提高机体的抗氧化能力，对酒精引起的大鼠急性胃黏膜损伤有保护作用。吴映明等[6]发现羊肚菌提取液可明显加强正常小鼠的胃肠运动，新斯的明负荷小鼠食用羊肚菌提取液，对其胃肠推进亢进也有明显的拮抗作用。殷伟伟等[7]对尖顶羊肚菌活性提取物的降血脂作用的研究发现，一个实验周期后，发现尖顶羊肚菌活性提取物能显著地降低高脂模型小鼠血清TC、TG、LDL-C、脾指数和肾指数，具有良好的降血脂效果。Kalyoncu等[8]研究了不同真菌菌丝体的抗氧化效果，发现高羊肚菌乙醇提取物清除羟基自由基的能力最强，抗氧化活性最好。Kim等[9]研究表明羊肚菌提取物能有效清除结肠癌细胞HT-29羟基自由基，抗氧化效果显著。赵英等[10]从DPPH自由基清除能力、还原能力和羟基自由基清除能力3个方面评估了羊肚菌甲醇提取物的体外抗氧化活性，发现羊肚菌在不同抗氧化途径中均具有良好的抗氧化活性，说明羊肚菌中含有某些具有抗氧化能力的化合物。

目前，对羊肚菌营养素和功能成分的研究趋向于蛋白质、多糖等大分子物质，对氨基酸、微量元素的研究仅限于生物学水平，没有对其进行深入的研究[11]。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为一种简单的模式生物，具有生长周期短、遗传背景清晰、表型容易观察等优点[12]，在生命科学研究领域中发挥了重要作用，并在用于植物提取物的抗氧化损伤方面的研究中具有重要的应用价值[13]。本研究以秀丽隐杆线虫为实验模式生物，对羊肚菌水提取物的体内抗氧化活性进行研究，观察其正常寿命、产卵量、运动行为、体内脂褐素含量（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力的影响，旨在为相关产品开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

1.1.1 主要试剂

羊肚菌水提物，实验室提取；秀丽隐杆线虫（C.elegans）:N2野生型秀丽隐杆线虫及大肠杆菌OP50由遗传学中心所提供。LB肉汤:广东环凯微生物技术有限公司；胰蛋白胨:广东环凯微生物技术有限公司；H2DCF-DA（2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯）:Sigma公司；SOD试剂盒、CAT试剂盒:南京建成生物工程研究所；其余均为分析纯。

1.1.2 主要设备

SW-CJ-2FD洁净工作台（上海博恒实业有限医疗设备厂）、万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、TGL-16B高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、UV-3010紫外分光光度计（日本日立高科技公司）、Enspire2003多功能酶标仪（美国pE公司）、FD-4型冷冻干燥机（labCAN）。

1.2 实验方法

1.2.1 羊肚菌水提物制备

准确称取50 g羊肚菌粉末（购于西藏林芝县）于1 000 mL 圆度烧瓶中，加水 500 mL，100 ℃回流提取90 min，过滤，滤渣回流提取 60 min，抽滤合并提取物，旋转蒸发、浓缩、真空冷冻干燥，配制成浓度为0、25、100、200 mg/mL的羊肚菌水提物溶液，保存备用。

1.2.2 秀丽隐杆线虫的培养

线虫生长培养基（Nematode Growth Medium，NGM）参考文献[14]。配制不同浓度（0、25、100、200 mg/mL）的羊肚菌水提物溶液，过滤除菌后，与大肠杆菌OP50菌液以5∶95的比例混合均匀。吸取100 μL样品于NGM平板上，喂养线虫。生长到L4期的线虫即可进行同期化。约48 h后线虫受精卵基本发育成L4期幼虫，完成同期化，可用于各项指标测定。

1.2.3 对秀丽隐杆线虫寿命的影响测定

挑取同期化后的L4期线虫到各组培养基当中，每个板中约有30条，每组设3个平行。从转移时刻起开始计算线虫的存活天数，转移当天记为实验的第0天，每天将它们转移到新的培养皿当中，到第4天后隔天将线虫转移到新的平板中以保证食物的充足。隔天探视线虫，并记录线虫死亡数。对线虫死亡判断标准为无移动及吞咽等动作，轻触后仍然无任何反应[15]。

1.2.4 对秀丽隐杆线虫产卵量的测定

每组挑取10条处于L4时期的线虫到各组培养基中，每个平板中放置2条线虫。每隔24 h后将线虫转移至新的平板中，转移4～5次后，线虫基本上已经不再产卵。将所有平板继续在培养箱中20 ℃孵育24 h后，待子代线虫孵化长大后，在其进入产卵期之前，对线虫的数目进行计数，计算每条母线虫在6～7个平板中产卵数的总和就是该线虫的产卵数量。

1.2.5 对秀丽隐杆线虫体内ROS水平的影响

ROS水平测定:经羊肚菌水提物处理96 h以后，将不同浓度组线虫转移到NGM板上以去除大肠杆菌。转移3次后，把线虫转移到含有50 μL的M9缓冲液的96孔荧光板上，每孔转移80条，每组设三个平行。与此同时将50 μL用M9缓冲液配制的100 μM的H2DCF-DA溶液加入到96孔板当中，用不含线虫的 H2DCF-DA 溶液50 μL 加 50 μL M9缓冲液做空白对照。立即将96孔板放入酶标仪当中测定荧光强度，反应温度25 ℃，发射波长528 nm，激发波长485 nm。每次读数前振荡，每隔20 min测定一次，共反应 6 h。

1.2.6 羊肚菌水提物对秀丽隐杆线虫体内SOD和CAT酶活力的影响

前期培养方法与寿命实验一样，经药物处理96 h以后，分别从空白组、样品组和阳性对照组挑200条线虫放入无菌水中冲洗，低速离心后去掉上清液，反复三次后定容至0.5 mL，低温匀浆（重复匀浆2次，1 s匀浆、1 s间隙，每次2 min）。匀浆后加入1%chap溶液定容至 1 mL，低温离心（4 ℃，12 000 r/min，15 min），收集上清液放置到4 ℃中待测。酶活力的测定，严格按照南京建成生物工程所SOD和CAT测试盒说明书要求的操作。

1.3 数据处理分析

将不同浓度条件下得到的各组数据即线虫寿命、体长、线虫一分钟活动次数和线虫体内荧光密度等数据使用Origin软件进行绘图，SPSS17.0 软件数据处理，进行差异显著性检验，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 羊肚菌水提物对秀丽隐杆线虫寿命的影响

本实验通过比较3个不同浓度的羊肚菌水提物样品对秀丽隐杆线虫寿命的影响，对线虫整个寿命周期的存活率做出寿命生存曲线图，如图1所示。羊肚菌水提物处理组秀丽隐杆线虫的平均寿命、最长寿命均高于对照组，且与羊肚菌水提物浓度呈现一定的剂量效应关系。100 mg/L与200 mg/mL组秀丽隐杆线虫的平均寿命显著高于对照组（P＜0.05），说明羊肚菌水提取物可以显著延长秀丽隐杆线虫寿命。但是，当质量浓度达到100 mg/mL时，秀丽隐杆线虫寿命提升率无显著差异（P＞0.05），结果如表1所示。

图1 羊肚菌水提物对秀丽隐杆线虫寿命的影响

表1 对线虫寿命的影响

2.2 羊肚菌水提物对秀丽隐杆线虫产卵量的影响

由不同浓度（0、25、100、200 mg/mL）的羊肚菌水提物溶液喂养线虫的总产卵量实验结果见表2。25 mg/mL羊肚菌水提物组秀丽隐杆线虫子代数量达到248个，显著高于对照组（p＜0.05）。而且线虫产卵量随着羊肚菌水提物浓度的增加而增加，25 mg/mL、100 mg/L、200 mg/L组间线虫产卵量均无显著性差异（p＞0.05）。本实验结果说明本研究所得羊肚菌水提物能提高线虫产卵量，但浓度的增加不会对秀丽隐杆线虫生殖能力造成显著影响（p＜0.05）。

表2 羊肚菌水提物对秀丽隐杆线虫产卵量的影响

2.3 羊肚菌水提物对秀丽隐杆线虫体内ROS的影响

由表3可知，与对照组相比，羊肚菌水提物能够显著降低线虫体内ROS积累量（p＜0.05），而且随着浓度的增大，ROS越小，100 mg/L与200 mg/L羊肚菌水提物组ROS水平分别下降了37.44%和23.50%，组间无显著差异。

表3 羊肚菌水提物对秀丽隐杆线虫体内ROS的影响

2.4 羊肚菌水提物对秀丽隐杆线虫体内SOD和CAT酶活的影响

如图2所示，在考察质量浓度范围内，羊肚菌水提物均可以显著提高秀丽隐杆线虫体内SOD、CAT活力（P＜0.05）。对照组0 mg/mL的羊肚菌水提物组的 CAT 活力为（150.05±1.00）U/mg prot，与对照组相比，25 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL 羊肚菌水提物组使CAT活力分别提高了26.11%、31.52%和37.41%。

如图3所示，不同浓度羊肚菌水提物组的SOD活力均极显著高于对照组（P＜0.01）。与对照组相比，25 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL 羊肚菌水提物组使SOD活力分别提高了55.46%、66.40%和75%。25 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL 羊肚菌水提物组间对SOD活力的影响无显著差异。

图2 羊肚菌水提物对秀丽隐杆线虫体内CAT的影响

图3 羊肚菌水提物对秀丽隐杆线虫体内SOD的影响

3 结论

秀丽隐杆线虫作为一个完整且简单的生命体，以其低成本、高效率的特点在活性成分评价方面优于小鼠等其他模式生物[16]，在植物提取物的体外和体内抗氧化活性之间架起了一座桥梁[17]，是研究植物提取物的抗氧化作用不可或缺的工具[18-19]。本研究以秀丽隐杆线虫为实验模式生物，对羊肚菌水提取物的体内抗氧化活性进行研究，观察其正常寿命、产卵量、体内脂褐素含量（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力的影响，发现羊肚菌水提物处理组秀丽隐杆线虫的平均寿命、最长寿命均高于对照组，且与羊肚菌水提物浓度呈现一定的剂量效应关系。线虫产卵量随着羊肚菌水提物浓度的增加而增加，但浓度的增加不会对秀丽隐杆线虫生殖能力造成显著影响（p＜0.05）。与对照组0 mg/mL相比，羊肚菌水提物能够显著降低线虫体内ROS积累量（p＜0.05），而且随着浓度的增大，ROS越小，100 mg/L下降了37.44%和200 mg/L 23.50%。羊肚菌水提物均可以显著提高秀丽隐杆线虫体内SOD、CAT活力p＜0.05）。与对照组相比，25 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL羊肚菌水提物组使SOD酶活力分别提高了55.46%、66.40%和75%；使CAT活力分别提高了26.11%、31.52%和37.41%。

综上所述，羊肚菌水提物可以提高相关抗氧化酶活力、有效减少线虫体内脂褐素积累、使得线虫寿命得到有效延长，改善机体的抗氧化能力。