单抗药物A003的影响因素试验研究

李慧，李月玲，邵喆

（宝船生物医药科技（上海）有限公司，上海 201203）

单克隆抗体类药物作为生物制品的一类，具有特异性高、靶向性强和毒副作用低等特点，广泛用于肿瘤、自身免疫病等多种疾病治疗[1]。近些年，单抗药物属于最热门的研发领域之一，每年的市场资金投入、药物获批数量都在急剧增长。稳定性考察是生物制品研发的重要组成部分，其包括影响因素研究、加速试验以及长期试验的考察[2-5]，必要时还应包括使用期间稳定性的考察[6-7]。加速试验是在加速条件下进行，通过加速药物的化学或物理变化，探讨药物的稳定性。长期试验是在接近药物的实际贮存条件下进行，其目的是为制定药物的有效期提供依据。影响因素研究是在比加速试验更激烈的条件下进行，其目的是探讨药物的固有稳定性、了解影响其稳定性的因素及可能的降解途径与降解产物，为产品生产、包装、贮存条件和分析方法的开发及验证提供科学依据[5]。中国药典（2015版）四部以及ICH相关指南中建议，生物制品在申报IND、生产规模扩大以及工艺变更后，均需要考察产品的稳定性。

本研究就生物制品稳定性考察中的影响因素试验展开研究。研究对象为单抗药物A003，A003是一个分子量为150 kD的全人源化的IgG1抗体，适应症为用于实体瘤的治疗。本研究中，将考察样品对光照、高温、剧烈振荡、异常环境温度、酸碱破坏、氧化破坏等异常储存条件的耐受程度，考察样品的主要降解途径及降解产物，为制定产品质量标准、储存、运输条件提供试验依据，并据此进一步验证所用分析方法的可行性，为后期选择包装材料提供参考。

1 材料及方法

1.1 试验材料

单克隆抗体A003，注射溶液剂，pH 6.0，20 mg/mL，10mL/支。

1.2 方法

影响因素试验包括光照、高温、剧烈振荡、低温循环、冻融循环、酸碱破坏、氧化破坏等考察因素。具体考察方法及取样时间点如下。

（1）光照试验。参考ICHQ1B指南[8]，将样品放置于稳定性综合试验箱（LHH-250GSD-UV，上海一恒，下同），同时暴露在冷白荧光灯和近紫外灯下，光照强度设置为（4 500±5 000）lx，温度设置为 10 ℃，在第0、4、8、14、30天取样检测。

（2）高温试验。将样品放置于稳定性试验箱，温度设置为40 ℃，避光，在第0、4、8、14、30天取样检测。

（3）剧烈振荡试验。将样品放置于25℃，转速100 r/min，恒温培养振荡器（ZHWY-Z11C，上海智诚）考察30天，第0、4、8、14、30天取样检测。

（4）低温循环。将样品于医用冷藏箱（HYC-940，海尔），2～8 ℃放置2天，然后转移至稳定性综合试验箱，（25±2）℃下放置2天，此为一个循环，放置三个循环，第0、4、8、12天取样检测。

（5）冻融循环。将样品于医用冷冻箱（DW-25L262，海尔），-20～-10 ℃放置2天，然后转移至医用冷藏箱（HYC-940，海尔），4 ℃下放置2天，此为一个循环，放置三个循环。第0、4、8、12天取样检测。

（6）酸破坏试验（pH3.0）。用50%醋酸将样品pH调节到3.0，于室温下第0、4、8、24 h取样，取样后用2 mol/L Tris将pH调整到6.0，然后检测。

（7）碱破坏试验（pH9.5）。用 2 mol/L Tris将样品pH调节到9.5，于室温下第0、4、8、24 h取样，取样后用50%醋酸将pH调整到6.0，然后检测。

（8）氧化破坏试验。取600 μL样品，加入400 μL H2O2（2%）混匀，37 ℃条件下放置，室温下第 0、1、2、3 h取样，取样后用空白缓冲液7000 G超滤换液去除残留的H2O2，然后检测。

1.3 检测项目

检测项目包括:外观、pH值、蛋白质含量、渗透压摩尔浓度、离子交换色谱、分子排阻色谱、CE-SDS还原电泳、CE-SDS非还原电泳、cIEF、抗原结合活性和细胞水平活性等。

pH值、蛋白质含量、渗透压摩尔浓度分别用pH计（FE28，METTLER），紫外分光光度计（UV-1900，岛津），渗透压测定仪（SMC 30C-1，天津天河）检测。

离子交换色谱（Cation Exchange Chromatography，CEX）:采用 HPLC（Agilent 1260）、阳离子交换色谱柱MabPacTMSCX-10（Thermo），蛋白样品进样后，经 流 动 相 A（20 mmol/L Tris，pH 8.1）、流动相 B（20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 8.1）进行盐离子梯度洗脱，带电荷组分分子会根据带正电荷由少到多的顺序被洗脱出来，经紫外检测器（280 nm）检测，从而达到分析样品电荷异质性的目的。

分 子 排 阻 色 谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）:采用 HPLC（Agilent 1260）、TSKgel G3000SWXL色谱柱（TOSOH），经流动相（100 mmol/L KH2PO4/ 100 mmol/L Na2SO4，pH6.7±0.02）等 度 洗 脱 20 min，按照分子大小依次被洗脱，经紫外检测器（280 nm）检测。该方法可达到分析样品分子大小异质性的目的。

CE-SDS还原电泳:使用毛细管电泳仪（PA800，Beckman-Coulter），样品经β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich）还原成重链和轻链，在毛细管（Beckman-Coulter）中依据分子量大小进行分离，经PDA检测器检测，从而达到定量测定产品纯度及非糖基化重链的目的。

CE-SDS非还原电泳:使用毛细管电泳仪（PA800，Beckman-Coulter），蛋白在非还原条件下，在毛细管（Beckman-Coulter）中依据分子量大小进行分离，从而达到定量测定重组单抗产品纯度的目的。

毛细管等电聚焦（Capillary Isoelectric Focusing，cIEF）:采用毛细管电泳仪（iCE3，ProteinSimple）检测抗体的等电点以及分析其电荷异质性。在电场作用下，样品、两性电解质和缓冲液混合物能在毛细管内形成稳定的pH梯度，当具有不同等电点（pI）的蛋白质在电场作用下迁移时，将聚焦在pH等于其等电点的位置，形成窄的聚焦区带。iCE3全柱成像检测系统会在聚焦过程中实时采集信号，形成等电聚焦图谱。

抗原结合活性:采用间接ELISA原理，在96孔板中包被可特异性结合样品的一抗（Sino Biological），并依次加入梯度稀释的样品和酶结合二抗（Sigma），用酶底物显色法（TMB，购自北京索莱宝）检测样品与一抗的结合量，用酶标仪（MD，thermo）读取数值，以样品浓度的对数值为横坐标，反应样品与一抗结合量的OD值为纵坐标，拟合出一条四参数曲线。通过比较待测样品和参比品的IC50值，计算待测品的抗原结合活性。

细胞水平活性:采用报告基因法进行检测。根据药物作用机理选择合适的信号通路和转录因子，构建一个靶启动子位于荧光素酶表达基因序列前方的报告基因质粒，转染细胞，获得反应细胞。当抗体加入反应体系时，信号通路被激活，转录因子与靶启动子结合，则荧光素酶基因就会表达，引起荧光发光，荧光强度与抗体浓度呈正相关。以抗体浓度的对数值为横坐标，相应浓度下荧光强度为纵坐标拟合出四参数曲线，获得样品和参比品的EC50值，用于计算样品的相对细胞水平活性。

1.4 数据分析

本研究所采用分析方法均经过方法验证，通常认为含量和纯度与初始值相差5%，或者生物活性指标超过70%～130%的范围判为显著变化。其他指标的变化关注变化趋势。

2 结果与分析

各影响因素试验的外观都没有变化，无色、澄清。其余结果见表1-表8。

2.1 光照试验结果

光照试验结果见表1，考察至30天，CEX主峰由56.6%降低至50.1%，酸性峰比例由33.8%上升至42.9%。cIEF的变化趋势与离子交换色谱结果的变化趋势一致。

表1 光照试验数据

2.2 高温试验结果

高温试验结果见表2，考察至30天，CEX主峰由56.6%降低至38.2%，酸性峰比例由33.8%上升至51.7%，cIEF变化趋势于CEX一致；SEC单体比例由99.5%降低至98.4%，聚体比例略有升高；非还原CE-SDS的主峰比例由97.6%降低至94.4%。其余结果无明显变化。

表2 高温（40 ℃）试验数据

2.3 剧烈振荡试验结果

剧烈振荡试验结果见表3，CEX、cIEF主峰比例略有降低，其余各项指标无明显变化。

表3 剧烈振荡试验数据

2.4 低温循环试验结果

低温循环试验结果见表4，各项指标均无明显变化。

表4 低温循环试验数据

2.5 冻融循环试验结果

冻融循环试验结果见表5，各项指标均无明显变化。

表5 冻融循环试验数据

2.6 酸破坏试验结果

酸破坏试验结果见表6，各项指标均无明显变化。

表6 酸破坏试验数据（pH 3.0）

2.7 碱破坏试验结果

碱破坏试验结果见表7，各项指标均无明显变化。考察至24 h，CEX主峰比例明显降低，由56.1%降至50.2%，酸性峰比例明显升高。其他指标无明显变化。cIEF的变化趋势与CEX一致。

表7 碱破坏试验数据（pH9.5）

2.8 氧化破坏试验结果

氧化破坏试验结果见表8，氧化破坏至3 h，非还原CE-SDS主峰由96.4%降低至71.9%，CEX主峰由54.8%降低至25.3%，酸性峰比例显著升高。cIEF主峰由57.9%降低至29.4%，抗原结合活性、细胞水平活性结果已由107%、110%分别降低至43%、42%。

表8 氧化破坏试验数据

3 分析及讨论

影响因素试验通常是生物制品考察稳定性的第一步，包括温度、光照、湿度、振摇、低温循环、冻融循环、酸碱破坏和氧化破坏等。通过这一系列的考察，了解产品对哪些考察因素比较敏感，哪些质量属性变化比较大，了解产品的主要降解产物及降解途径，进一步验证所用分析方法的可行性，为后期产品的储存、运输、包装材料的选择、质量标准的制定提供参考。因此，做好影响因素试验考察非常重要。

本研究针对单抗药物A003展开影响因素试验研究，结果表明:（1）A003对高温、光照、氧化破坏比较敏感，电荷异质性发生了显著的变化，表现为主峰比例显著下降，酸性峰比例显著升高；纯度变化表现为单体比例有明显下降趋势，聚体比例有明显升高趋势。在氧化破坏试验中，生物活性指标降低显著；（2）剧烈振荡对A003有轻微破坏，电荷异质性变化趋势明显，主峰比例有降低的趋势，酸性峰比例有升高的趋势；（3）A003在其他因素考察试验中，没有明显变化。

在影响因素考察中发现，最敏感的考察项目是CEX、cIEF。这两项也是最常用的分析单抗电荷异质性的方法，根据出峰时间先后分为酸性峰、主峰和碱性峰。一般认为N糖基化、C末端赖氨酸丢失、氨基酸氧化、天冬酰胺脱酰胺化及天冬氨酸异构化、N末端谷氨酰胺及谷氨酸环化是较常见的产生电荷异质性的原因[9]。电荷异质性也是影响抗体活性的重要因素，有研究表明高水平的唾液酸化会影响单抗与FcγRIIIa的结合，进而导致ADCC活性减弱[10]。此外，天冬酰胺脱酰胺化可以发生在抗体的恒定区或可变区，当发生在可变区，可能对抗体的结合活性产生一定的影响[11]，还没有明确的证据证明C末端赖氨酸丢失、蛋氨酸氧化、N末端谷氨酸或谷氨酰胺环化对抗体会造成影响[12]。尽管大多数电荷变异体对抗体的生物学活性无显著影响，但当电荷变异值接近一个pI单位时，可能影响药物的组织分布和药代动力学[13]。因此，尽量控制电荷异质性的变化，对于产品的安全性、有效性至关重要。

在影响因素考察中，另外一个敏感指标是纯度。虽然抗体药物在最初生产出来时，因经过一系列的纯化过程，最终都是高纯产物，但是在产品储存、运输以及给患者的使用过程中，纯度会降低，都会产生不可逆的聚体[14]。聚体的存在（无论是人源化的还是全人源的蛋白），会显著增加引起病人对药物起免疫反应的风险，在极少数情况下，可能引起严重的安全问题[15]。聚体通常保留原来单体的二级结构或者三级结构的一部分，还具有不可逆性。这两个特征组合起来，使得聚体更容易引起免疫原性[16-17]。因此，为保证单抗产品的有效性及安全性，因严格控制聚体的产生。

生物学活性是决定抗体在治疗疾病中是否有效的重要条件。本研究中氧化破坏，引起A003生物学活性的显著降低，应该尽量避免。

综上所述，引起A003明显破坏的影响因素是高温、光照、氧化；引起A003轻微变化的影响因素是剧烈振荡、碱破坏；易引起变化的质量属性是电荷异质性、纯度、生物学活性。因此，产品在储存、运输过程中应尽量避免接触空气，避免高温及光照的条件。