1例斑驳病大家系临床表型及基因突变研究

葛宏松，李 越，张 成，漏 琼，李 明

斑驳病的最具特征的临床表现是额部、发际部呈三角形或菱形白斑，常伴有横跨发际的白色额发；此外白斑常见于上胸、腹部及四肢，偶见于面部、手足、背部等部位。白斑出生后即发生，终生稳定存在，部分患者的白斑周边、甚至中央可以出现不同程度和大小的色素沉着斑[1]。组织病理学显示，白斑部位黑素细胞完全缺失。临床上表现各异，尽管是同一个家系成员，其临床表现也不完全相同。斑驳病是一种罕见的常染色体显性遗传性皮肤病，由于黑素细胞先天性发育不良导致的色素脱失性疾病[2]。位于人类染色体4q12上的编码肥大/干细胞因子(stem cell actor, SCF)细胞表面跨膜受体KIT的基因突变(也称c-kit或CDll7基因)，导致胚胎发育期黑素母细胞的增殖、分化和迁移发生障碍,从而引起斑驳病的发生[3]。到目前为止在斑驳病中，已有70多个KIT基因突变被报道[2-7]。该研究报道1例斑驳病大家系中存在新的KIT基因突变位点及外显不全表现。

1 材料与方法

1.1 家系情况1家3代14位成员，其中患者4例，见家系图1。先证者(Ⅲ：2)，男，2月，父母非近亲结婚。查体：一般情况良好，发育正常。皮肤科专科检查：先证者出生时即发现前额可见菱形分布的白斑横跨发际线，白斑处头发为白发，前胸、腹部、四肢可见弥漫性分布且相互融合的大片状脱色素斑，部分白斑周边可见数个类圆形钱币大小的淡褐色色素沉着斑，面积超过50%。此外，左小腹部可见深褐色咖啡斑。家系其他成员调查：先证者外公及大姨前额、双小腿有大面积界限清晰的白斑，部分白斑内可见少许散在的色素斑，先证者姐姐双小腿有大面积界限清晰的白斑，先证者母亲未见明显皮损；Wood灯下可见大片状界清的脱色素白斑，同时白斑区内可见弥漫分布、程度不均的类圆形色素沉着斑。见图2。

图1 家系图

1.2 外周血基因组DNA提取研究遵照赫尔辛基宣言，并由安徽省儿童医院伦理委员会审查通过。在征得所有患者以及正常人的知情同意后，采集所有家系成员及100例与本家系无关正常人的外周静脉血3 ml。用DNA提取试剂盒(购自美国普罗米加公司)提取基因组DNA。

图2 典型病例的临床表现

图3 KIT基因突变图

1.3 PCR扩增在线查取KIT基因mRNA序列经BLAST比对得到KIT基因的基因组序列(http://www.genome.UCSC.edu/)，应用Primer3.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.O/primer3/)在线平台设计针对KIT基因全部编码外显子的特异性引物进行PCR扩增，包括外显子及内含子交界50 bp的序列。采用25 μl的反应体系：10x缓冲液2.5 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，50 pmol/L双向引物混合物0.5 μl，TaqDNA聚合酶1.0 U，DNA模板1.0 μl (20 ng)，加双蒸水至25 μl。PCR扩增程序如下：5 min升温至94 ℃，并在94 ℃变性持续30 s，于55～60 ℃退火，持续30 s，于72 ℃延伸，持续45 s，共38个循环，72 ℃终极延伸45 s。所有PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测验证。

1.4 DNA直接测序PCR产物送上海安百隆生物技术服务有限公司进行正向测序，测序结果与人类基因组KIT基因序列比较，如发现突变再行反向测序进行验证。

2 结果

成功扩增了KIT基因内所有外显子以及外显子与内含子交界区的基因序列。先证者的测序结果显示KIT基因外显子内第272位碱基A突变为T(c.272A>T)；在家系内另3例患者及家系中正常成员先证者母亲也都检测到了该突变，而在家系中其他正常成员及100名正常对照经测序均未发现以上两个突变，因此排除了以上碱基改变为单核苷酸多态性的可能。见图3。

3 讨论

目前研究表明，斑驳病主要是由编码SCF受体的KIT基因突变引起，该突变导致受体功能的部分缺失[1]。人类KIT基因组位于4号染色体长臂区(4q12)，DNA全长大约89 kb，包括21个外显子。SCF受体是一种受体酪氨酸激酶，斑驳病患者的KIT基因发生突变后，SCF受体功能下降，从而影响其介导的多条信号分子通路，进一步抑制胚胎期的成黑素细胞的增殖，导致胎儿出生后的色素形成异常，引起斑驳病。

目前被检测出KIT基因的突变类型有：点突变、不同位点发生碱基缺失或缺失、核苷酸剪接位点突变等，以上所有基因突变的结果均可导致KIT受体功能不同程度的改变，从而造成酪氨酸激酶功能的部分丧失或缺失，引起斑驳病特有临床症状的发生。迄今报道KIT基因突变约有70多种，大多数为无义或错义突变，其次是该基因的剪切位点突变。研究发现斑驳病临床表型的轻重与KIT基因突变的不同位点密切相关，KIT基因突变对SCF/KIT信号传导途径功能损害越大，其临床表型越严重。

近年来，国内外相继报道了一些KIT基因的错义突变，即c.1861G>A、c.1872G>A、c.860T>A、c.1861G>A和c.2017T>G等[2-7]。本例家系于第91位密码子出现错义突变c.272A>T(p.Asn91Ile)，即属于此种突变，家系中患者之间显示出了较大的表型变异，其中最为严重的是先证者，先证者、家系内另3例患者及家系中正常成员先证者母亲也都检测到了KIT基因外显子内第272位碱基A突变为T(c.272A>T)存在该突变，此突变位点经文献检索未发现有类似报道。该家系中先证者母亲携带该突变，但目前为止未发现皮肤及毛发色素异常，可能为外显不全，原因可能在于除了KIT基因之外，可能存在其他调控基因影响疾病的发生，当然先证者的母亲随着随访的时间延长，也会出现轻症的临床表现。KIT基因该位点的突变致病分子机制值得我们进一步研究。