Hsp16.3在结核分枝杆菌潜伏感染中的作用

结核病(Tuberculosis，TB)主要是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)感染引起的慢性传染性疾病。据世界卫生组织(WHO)估计，2014年新增约960万例结核病例和150万例死亡病例[1]。世界约有1/3的人口携带Mtb，其中90%的携带者处于潜伏感染状态[2](latent TB infection, LTBI)，这是结核病复发的主要因素。在LTBI状态下，Mtb可保持稳定但可逆的非复制状态许多年，称为休眠(dormant，D)。休眠型Mtb(D-Mtb)是导致潜伏性结核感染(LTBI)的主要原因[3-4]。此时，D-Mtb可在体外培养，并对严重缺氧或营养剥夺的不利存活条件具有抗性[5-6]。同时，休眠型杆菌可以调节自身代谢以适应宿主环境并干扰宿主免疫系统，进而持续存在于体内的机制仍不十分清楚。

巨噬细胞是阻止体内Mtb扩散的主要屏障，巨噬细胞自噬是对抗Mtb的重要免疫机制。 自噬途径的启动促进吞噬体的成熟以及与溶酶体的融合，最终导致细胞内Mtb被清除[7-8]。 最近的研究已证实，巨噬细胞内的Mtb可以通过调节其自身的基因表达来抑制吞噬体成熟和/或吞噬体-溶酶体融合，使其免受宿主免疫应答的清除，从而有利于其存活并导致适应性免疫和LTBI的建立[9]。 因此，潜伏感染的Mtb能够逃避巨噬细胞的自噬[10]。

已经报道了几种Mtb分泌蛋白有助于Mtb的持续性感染，其中之一是热休克蛋白16.3(Heat Shock Protein 16.3, Hsp16.3，也称为Rv2031c，HspX或Acr)，它们对于维持Mtb的稳定性和长期生存力具有重要作用。在LTBI中，Hsp16.3的高表达，表明其参与了Mtb休眠菌的形成[11]。在巨噬细胞或无氧环境中，Hsp16.3的表达量可增加至Mtb中总细菌蛋白的25%，使细胞增厚以防止宿主细胞诱导的免疫损伤[12-13]。因此，Hsp16.3可能通过一些途径调节巨噬细胞的自噬功能，从而维持宿主细胞中Mtb的存活。本文我们将讨论休眠细菌如何通过Hsp16.3调控自噬，从而逃逸巨噬细胞自噬体的作用，提示Hsp16.3有可能作为LTBI的潜在生物标志物和抗结核药物的新靶点。

1 休眠的结核分枝杆菌和自噬

LTBI是产生阳性结核菌素试验(PPD)的亚临床状态，但是其胸部X射线检测无明显的结核感染迹象[14]。在这种状态下，休眠杆菌可以在宿主体内存活但不产生任何症状或体征，直至某些条件得到满足，此时杆菌突然从休眠中复苏，开始复制，最终导致结核病发生[9]。研究发现，在低氧环境中，Mtb会改变某些酶(如柠檬酸水解酶)的表达，从而改变其代谢途径而进入休眠状态[15]。作为对Mtb感染的主要屏障，活化的巨噬细胞释放有毒的活性氧和氮来直接杀死Mtb，而自噬则对胞内病原体的清除发挥了重要作用[16]。Cheallaigh等[10]证实巨噬细胞通过增加自噬体成熟及自噬体-溶酶体融合来启动细胞自噬以除去感染细菌。Gutierrez等[17]和Amano等[18]发现自噬与巨噬细胞中Mtb的活性密切相关。此外，自噬促进树突状细胞(DC)的成熟，并刺激适应性免疫应答以除去细胞内的细菌[19]。当用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和针对beclin-1的siRNA(atg6)一起处理DC或巨噬细胞时，2种细胞的抗原呈递能力均显著降低，自噬发生减弱。这增加了细胞内分枝杆菌的生存能力，并降低了它们的清除率，使之持续感染[20]。因此，LTBI与巨噬细胞自噬密切相关。这种关系存在的潜在原因包括： 1)休眠菌可阻止吞噬体成熟及吞噬体-溶酶体融合; 2)Mtb改变了巨噬细胞自噬相关基因的表达以阻碍病原体向溶酶体的输送并防止溶酶体降解。这使得Mtb能够存活、复制并最终从巨噬细胞逃脱[16]。

2 Hsp16.3和LTBI

Hsp16.3是α-晶状蛋白型热休克蛋白，由144个氨基酸组成，分子量约为16.3 kDa。α-晶状蛋白结构域是位于C-末端的90～100个氨基酸残基[21]，它是Mtb免疫原性最强的潜伏相关抗原之一。敲除实验显示Hsp16.3是巨噬细胞中Mtb复制的关键因子[22]。当Mtb在低氧条件下培养或在巨噬细胞中生长时，Hsp16.3的表达被上调[23]。acr基因的缺失明显减弱了Mtb的毒力，并显著削弱了其在小鼠骨髓衍生的巨噬细胞和THP-1巨噬细胞中的生长[24]，这表明Hsp16.3的表达提高了Mtb在巨噬细胞中的生存能力。体外研究显示，在LTBI中，Mtb增加了编码Hsp16.3的DosR(休眠存活调节基因)，特别是Rv2031c的表达[25]。根据其在先天性和适应性免疫反应中的重要功能，Hsps被认为是结核病理想的生物标志物[26]，特别是Hsp16.3与Mtb休眠状态有关。

高水平的Th1细胞因子和ROS可促进Mtb感染的巨噬细胞的自噬[27]。在Mtb感染的早期阶段，Hsp16.3分泌诱导巨噬细胞产生IFN-γ以清除Mtb[21]。然而，在豚鼠实验中，基于Rv2031c的疫苗接种显示通过增强的IL-12，IL-10和TGF-β的产生来提供对抗结核的保护作用[28]。在LTBI期间，Rv2031c可诱导产生高水平的IL-10[29]，IL-10和TGF-β通过抑制T细胞产生IFN-γ，阻断或抑制巨噬细胞活化和凋亡，从而使Mtb在巨噬细胞中存活。已有实验证实宿主中IL-10的增加与细菌抗性的降低相关[30]。肺泡巨噬细胞、单核细胞衍生的巨噬细胞或THP-1细胞在感染了野生型或Mtb减毒株后，用抗IL-10抗体进行处理，显著促进吞噬体成熟[31]。IL-10主要是通过激活转录因子3(STAT3)途径抑制自噬体的成熟，这与报道的STAT3参与IL-10介导下调宿主的炎性反应相一致[32]。图1显示了我们推测在LTBI中Hsp16.3干扰巨噬细胞自噬的作用模式。

图1 Hsp16.3可能参与Mtb感染中抑制巨噬细胞自噬的信号通路Fig.1 The signaling pathway of Hsp16.3 inhibiting autophagy in macrophages in Mtb infection

一些研究揭示了α-晶体蛋白在调节细胞活力和保护中枢神经系统中的作用，该蛋白可直接作用于线粒体以减少氧化应激[33]。据报道，细胞外α-晶体蛋白通过激活MAPK / PI3K / Akt信号通路，并阻断线粒体释放ROS来保护星形胶质细胞[34]。因此，Hsp16.3可以通过活化抑制自噬的信号传导途径来调节ROS的产生。然而，细胞因子与Hsp16.3之间是否存在明确的联系，以及Hsp16.3影响细胞因子产生的机制还需要进一步的研究。

在LTBI中，Hsp16.3通过IL-10的产生，一方面抑制T细胞产生IFN-γ，抑制巨噬细胞活化，同时IL-10通过激活STAT3途径抑制自噬体的成熟和ROS的产生抑制自噬的发生。

近期的研究中报道，通过评估小鼠巨噬细胞RAW264.7中LC3II免疫荧光斑点的表达，观察了Mtb中Hsp16.3基因缺失(Hsp16.3ΔMTB)对巨噬细胞自噬的影响[35]。结果显示Hsp16.3缺失促进了巨噬细胞中自噬的形成，支持了Hsp16.3抑制LTBI中的巨噬细胞自噬的假说。为了证实Hsp16.3ΔMTB诱导自噬的发生而不是抑制自噬降解，将巨噬细胞在巴弗洛霉素A1(BAF)处理后用Hsp16.3ΔMTB感染。此时，LC3 II的表达高于未用BAF处理的Hsp16.3ΔMTB感染的细胞。此外，通过形态观察和计算分析了RAW 264.7细胞吞噬的Hsp16.3ΔMTB的CFU。结果显示Hsp16.3ΔMTB感染用雷帕霉素处理的巨噬细胞，只存活少量的Mtb，而用3-MA抑制剂和BAF处理的巨噬细胞可观察到更多的Mtb。这些结果表明LC3II斑点的积累可以被解释为自噬增加而不是自噬成熟的抑制[35]。

3 Hsp16.3是LTBI的潜在生物标志物

由于结核病复发率高，因此迫切需要及时、准确地检测和诊断LTBI。尽管结核菌素皮肤试验是传统的检测方法，但其诊断LTBI的能力有限，并且在接种BCG的个体中受到高假阳性率的困扰[36]。基于T细胞的IFN-γ释放试验(IFN-g release assay，IGRA)更广泛地用于LTBI的检测，但由于其不能区分LTBI与活动性TB，所以仍然需要高灵敏度和特异性的免疫标记物。我们尝试制备了Mtb分泌蛋白(ESAT6，CFP10，Ag85B，Hsp16.3)和融合蛋白Ag85B-Hsp16.3，通过ELISA检测针对这4种分泌蛋白的IgG血清抗体，在活动性结核患者和LTBI患者中评估确认感染的能力[37]。结果显示：Ag85B-Hsp16.3 / ESAT6和Hsp16.3 / ESAT6是活性TB和LTBI个体血清学诊断的最佳关联抗原，ELISA检测结果显示41.67%(25/60)献血员对Ag85B-Hsp16.3 / ESAT6有反应。这种阳性反应与临床诊断的一致性几乎达到84%。提示基于Hsp16.3的多种Mtb分泌蛋白Ag85B和ESAT6的联合检测可能是区分活动性TB和LTBI患者的有效筛选抗原。

Hsp16.3不仅与宿主内Mtb的稳定性相关，而且含有多个人T细胞和B细胞表位[38-39]；如其～p91-p110，～p21-p29和～p120-p128多肽表位都能够活化CD4+T细胞和CD8+T细胞，通过分泌IFN-γ清除Mtb的感染[40]。Belay等人[29]在LTBI患者中发现针对Rv2031c诱导高水平的TNF-α和IL-10。这提示针对Rv2031c的TNF-α和IL-10拮抗剂可能是LTBI患者保护性免疫的潜在生物标志物。因此，Hsp16.3可作为活动性结核病和LTBI患者诊断的辅助指标[37]，对高危患者的结核病筛查和早期诊断具有重要意义。

4 展 望

除了作为一个潜在的诊断标志物，HspX还能在应激条件下(包括休眠状态)通过调节参与宿主代谢的关键酶来适应宿主环境，从而维持Mtb蛋白的稳定性[41]。Hsp16.3的分子伴侣活性依赖于N-末端的结构和C-末端的α-晶状体蛋白结构域[42]。在晶状体结构域的疏水表面和在N-端区域的疏水残基具有底物分子的主要结合位点，如荧光素酶(Luc)、柠檬酸合成酶和苹果酸脱氢酶(MDH)等[43-44]。这些酶可能会影响休眠菌和宿主之间的相互作用，或是改变Hsp16.3的结构抑制细菌生长[22]。进一步研究，以探索Mtb通过Hsp16.3抑制宿主细胞自噬发生的特定分子信号通路和相关的调控分子，可能会发现新的结核病候选药物和潜在的LTBI生物标志物，有助于控制LTBI的发生。