抗柯萨奇病毒A16型单克隆抗体的制备和应用

刘 杨，赵向绒，余鹏博2，郭春艳，李 研，赵彭花，胡 军

柯萨奇病毒A 16(Coxsackievirus A16)属于小核糖核酸病毒科(Picornaradae)，无包膜单股正链RNA病毒，基因组约7.4 kb，病毒颗粒呈20面体立体对称球形结构。CA16和EV71是引起手足口病的主要病原体， 5岁以下儿童普遍易感，临床表现为手、足、口部疱疹和疱疹性咽峡炎等症状，少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎等并发症，大多研究认为CA16主要引起轻症感染，但是也有报道CA16患者中可出现严重的神经系统损伤[1-2]。因此，CA16早期快速检测和诊断尤为重要，目前用于CA16检测技术主要包括病毒分离、血清学检测和分子生物学检测。此次研究主要是通过CA16病毒大量培养，利用氯化铯密度梯度离心技术纯化病毒颗粒，以纯化的病毒抗原作为免疫抗原制备特异性抗CA16单克隆抗体，在单抗基础上建立CA16胶体金免疫层析快速检测方法，为临床快速诊断和流行病学监测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1病毒培养 用DMEM/F12 1∶1(含10%胎牛血清，购于Hyclone)培养基培养RD细胞，待长至单层后，PBS洗细胞3次，加入DMEM/F12 1∶1培养基(含1%胎牛血清)，接种CA16病毒液(CA16病毒株为本中心实验室分离株)，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，每日观察细胞病变情况(CPE)，待细胞病变达到75%时收获病毒培养上清，-70 ℃冰箱保存备用。

1.2病毒颗粒纯化 收获的病毒培养上清反复冻融3次(-70 ℃～37 ℃)，3 000 r/min离心20 min,收集上清后用0.45 μm滤膜过滤，收集滤液20 000 r/min 7 ℃离心4 h(HITACHI)，PBS重悬并溶解病毒沉淀。依次加入重氯化铯梯度液(密度=1.45 g/mL)、轻氯化铯(密度=1.19 g/mL，含结晶紫染料)、病毒重悬液。20 000 r/min 7 ℃离心4 h。收取蓝色病毒分离层，4 ℃条件下用透析袋对纯化产物进行透析。纯化产物-70 ℃保存备用。

1.3透射电镜观察病毒颗粒 取福尔马林灭活的病毒样品滴加到铜网上，10 min后取铜网置于2%磷钨酸溶液中负染10 min，铜网在灯上烤干后进行透射电镜观察(HITACHI，H-600)。

1.4单克隆抗体的制备 CA16病毒纯化产物用福尔马林灭活(1/4 000),腹腔免疫BALB/c小鼠(雌性，8周龄，体重18～20 g，购自第四军医大学实验动物中心)。间隔2周加强免疫，融合前3 d，腹腔追加免疫。无菌取免疫小鼠脾脏研磨并与Sp2/0细胞混合，用 50% PEG4000溶液进行细胞融合，将融合细胞加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，用HAT培养基选择培养，用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清液，筛选的阳性孔按有限稀释法亚克隆，建立mAb细胞株。1640培养基(含10%胎牛血清)培养阳性杂交瘤细胞，杂交瘤细胞一部分冻存作为细胞种子，一部分腹腔内注射BALB/c小鼠(腹腔内注射0.2 mL石蜡油后10 d的小鼠)，注射量为 0.2 mL(1.25×104个细胞)，10 d左右收集腹水。

1.5单克隆抗体反应特性鉴定 抗体类和亚类的鉴定，按照Southern biotech公司mAb亚型鉴定试剂盒说明书进行。抗体效价的测定，用建立的ELISA方法检测，对单抗腹水依次做倍比稀释，进行ELISA试验，同时用Sp2/0细胞腹水作阴性对照。单克隆抗体的特异性和交叉反应性鉴定，分别将CA16抗原、EV71抗原、柯萨奇病毒B3型(CB3)、ECHO11抗原(本实验室分离病毒株)、胎牛血清、RD细胞碎片等不同抗原包被ELISA板，分别加入单克隆抗体，检测与抗原是否有交叉反应性。

1.6免疫荧光试验 预先在12孔培养板中无菌放入载玻片，以1×105个细胞/孔 滴加RD细胞悬液，待细胞贴壁后接种CA16病毒，设立正常细胞对照孔，待接种CA16病毒的细胞病变效应达到50%时弃去上清，加入4%多聚甲醛室温固定1 h，PBST洗3次，加入抗CA16单克隆抗体，37 ℃孵育1 h，PBST洗6次，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗(购于Thermo Scientific)， 37 ℃避光孵育1 h，PBST洗6次，加入Hoechst 33342(Invirogen)室温避光染细胞核20 min，PBST洗6次，置荧光显微镜下观察。

1.7细胞免疫化学试验 预先在12孔培养板中无菌放入载玻片，以1×105个细胞/孔 滴加RD细胞悬液，待细胞贴壁后分别接种CA16、EV71病毒，设立正常细胞对照孔，待接种病毒的细胞病变效应达50%～75%时弃去上清，用10%甲醛室温固定1 h，PBST洗3次，加入3% 过氧化氢溶液室温孵育20 min，5% 牛血清白蛋白37 ℃孵育1 h，加入抗CA16单克隆抗体，37 ℃孵育1 h，PBST洗6次，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗(购于Thermo Scientific)， 37 ℃孵育1 h，PBST洗6次，DAB显色5 min，PBST洗6次，加入苏木素室温染色10 min，分化、返蓝后置显微镜下观察。

1.8细胞ELISA 以1×104个细胞/孔 滴加RD细胞悬液至96孔细胞板中，待细胞贴壁后分别接种0.1、1、10、100和1000 TCID50的CA16，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h，弃去上清，加入甲醇与丙酮等量混合的固定液室温固定细胞 30 min，加入过氧化氢尿素溶液 室温静置20 min，5% 牛血清白蛋白37 ℃孵育1 h，加入抗CA16单克隆抗体，37 ℃孵育1 h，PBST洗6次，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗(购于Thermo Scientific)，PBST洗6次，加入TMB显色液，37 ℃孵育10 min，加入2 mol/L H2SO4终止液，测定酶标板孔吸光度450 nm值(OD450)。

1.9金标抗体液的制备 向胶体金颗粒溶液中加入30%的双氧水，磁力搅拌10 min，加0.2 mol/L的碳酸钾，搅拌10 min，加入纯化的单克隆抗体0.2 mg，搅拌60 min，加入牛血清白蛋白0.1 g；搅拌10 min，加入聚乙二醇0.01 g；搅拌30 min。8 000 r/min离心10 min浓缩金标抗体。用胶体金稀释液溶解(胶体金稀释液组成：牛血清白蛋白1%,蔗糖2.5%；吐温-20 0.05%；磷酸缓冲液0.01 mol/L，pH7.4；叠氮钠0.1%)。

1.10胶体金试纸条组装 用喷金仪在金标垫上均匀铺上金标抗体，烘干。用点膜仪将纯化的单抗以2.5 mg/mL的浓度喷入反应膜上(检测线)，将山羊抗小鼠IgG(购于Thermo Scientific)以1 mg/mL的浓度喷入膜上(对照线)，室温晾干，即制备出反应膜。将样品垫、金垫、反应膜、吸收垫、背衬等部分组装成胶体金免疫层析试纸条。

1.11胶体金免疫层析试纸条的特异性和敏感性分析 用组装的胶体金试纸条分别对CA16培养上清、EV71培养上清和柯萨奇病毒B3进行检测试验。用PBS对108.25TCID50/0.1 mL的CA16病毒株进行倍比系列稀释，分别用胶体金试纸条对每个稀释度的CA16病毒样品进行检测，观察并收集结果。

2 结 果

2.1病毒培养和纯化 收获病毒培养产物，经超离浓缩和氯化铯密度梯度超速离心纯化后，CA16病毒颗粒处于轻氯化铯梯度液与重氯化铯梯度液之间，同时，结晶紫将病毒颗粒染成蓝色，可见蓝色病毒层(图1)。

图1 氯化铯密度梯度离心纯化CA16病毒颗粒Fig.1 Purification of the CA16 virus by cesium chloride density gradient ultracentrifugation

2.2透射电镜观察 福尔马林灭活的CA16病毒颗粒经透射电镜观察显示，病毒颗粒呈二十面体立体对称球形结构，直径大约20～30 nm之间，大小均匀，同时，有空心病毒颗粒(图2)。

图2 透射电镜观察纯化的CA16病毒颗粒(250 000×)Fig.2 Photographs of CA16 viral particles as analyzed by transmission electron microscopy(250 000 ×)

2.3单克隆抗体制备和特性分析 CA16病毒纯化产物灭活后免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾脏研磨与SP2/0细胞融合，筛选出1株分泌抗CA16单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名mAb CA16-19。免疫荧光试验显示(图3)，该株单抗特异性与CA16病毒反应。用间接ELISA法检测抗体效价10-5。抗体亚型ELISA检测结果显示，单抗为IgG2a亚型。单抗交叉反应性结果显示，单抗与EV71、CB3和ECHO11病毒均不产生交叉反应。

图3 mAb CA16-19细胞免疫荧光试验(400×)Fig.3 Immunofluorescent assay of mAb CA16-19(400 ×)

2.4细胞免疫化学染色 细胞免疫化学染色显示，mAb CA16-19 与CA16感染RD细胞结合，细胞内有棕色着色，mAb CA16-19 不与EV71感染RD细胞组和正常RD细胞组结合，免疫化学染色只有蓝色细胞核着色(图4)。

A：CA16感染RD细胞组；B：EV71感染细胞组；C：正常RD细胞对照组。图4 mAb CA16-19 细胞免疫化学染色(400×)Fig.4 Cell immunochemical staining of mAb CA16-19(400×)

2.5细胞ELISA 细胞ELISA中，推测细胞内源性过氧化物酶影响ELISA特异性检测，因此，用不同浓度过氧化氢尿素处理细胞板。正常RD细胞组ELISA检测显示，不同浓度过氧化氢尿素处理组间吸光度值差异无统计学意义(F=0.581，P>0.05)。CA16感染RD细胞组ELISA检测显示，CA16感染RD细胞后，不同浓度过氧化氢尿素处理组间吸光度值差异有统计学意义(F=9.153，P<0.01)，6 000 mg/L组与0 mg/L 组间有统计学意义(t=-0.429，P<0.01)，其他组与0 mg/L 组间比较均无统计学差异(P>0.05)。细胞ELISA表明，细胞内源性过氧化物酶对细胞ELISA吸光度值影响较小，但当过氧化氢尿素浓度为6 000 mg/L时，可降低吸光度值，而当过氧化氢尿素浓度在0～1 500 mg/L间时，对ELISA吸光度值无影响(图5)。细胞ELISA中可不用进行内源性过氧化物酶处理。不同病毒滴度的CA16感染RD细胞24 h后，随着病毒滴度增加，吸光度值也显著增加。此次细胞ELISA的临界值或Cut off=2.1×N，当病毒滴度为0(正常细胞对照)时对应的吸光度值为N，Cut off=2.1×N=2.1×0.12=0.252，利用mAb CA16-19建立的细胞ELISA最低检测线为10 TCID50(图6)。

过氧化氢尿素浓度(mg/L)图5 不同浓度过氧化氢尿素溶液控制细胞ELISA细胞内源性过氧化物酶比较Fig.5 Comparison of different concentrations of urea peroxide to inhibit endogenous peroxidases in cell-based ELISA

病毒滴度(TCID50)图6 不同病毒滴度感染RD细胞后利用mAb CA16-19 通过ELISA检测分析Fig.6 Analysis of RD cells infected with different virus titers were detected by ELISA utilizing mAb CA16-19

2.6胶体金免疫层析试纸条的特异性和敏感性分析 利用前期制备的mAb CA16-10[3]标记胶体金，将mAb CA16-19单抗用点膜机喷入反应膜上作为检测线，组装胶体金免疫层析试纸条，用组装的胶体金试纸条对CA16、EV71和柯萨奇病毒B3进行特异性检测试验，仅CA16病毒培养上清可在检测线和质控线上出现红色条带，EV71和柯萨奇病毒B3培养上清只在质控线上出现红色条带(图7)。用试纸条分别对不同稀释度的CA16样品进行检测，在3.125×106.25TCID50/0.1 mL稀释度的检测线上出现较弱红色条带，质控线清晰可见，而在6.25×106.25TCID50/0.1mL稀释度的检测线和质控线均有明显红色条带，因此，该胶体金试纸条的检测限为6.25×106.25TCID50/0.1 mL(图8)。

A：EV71培养上清；B：柯萨奇病毒B3培养上清。图7 胶体金免疫层析试纸条的特异性分析Fig.7 Specificity analysis of colloidal gold immunochromatographic assay

A:2.5×107.25TCID50/0.1 mL;B:1.25×107.25TCID50/0.1 mL;C:6.25×106.25TCID50/0.1 mL;D:3.125×106.25TCID50/0.1 mL;E:1.56×106.25TCID50/0.1 mL;F:7.8×105.25TCID50/0.1 mL;G:3.9×105.25TCID50/0.1 mL。图8 胶体金免疫层析试纸条的灵敏性分析Fig.8 Sensitivity analysis of colloidal gold immunochromatographic strips

3 讨 论

CA16和EV71引起的手足口病已成为我国较为严重的公共卫生问题，对疑似患者进行早期检测，及早给予治疗措施显得非常重要。而在人群中及时发现感染患者并采取防控措施，可大大降低疾病流行和暴发风险。因此，建立CA16的早期快速检测方法非常重要。目前CA16的检测和实验室诊断主要包括病毒分离培养、血清学检测和分子生物学检测，其中病毒分离培养是实验室诊断的金标准，但是病毒分离周期长，操作需要二级生物安全实验室和专业培训等因素，限制了该方法的广泛应用。血清学检测中，常用中和试验和酶联免疫吸附试验，主要检测血清中特异性IgM和IgG，中和试验需要采集急性期和恢复期血清样本，不能进行早期诊断，多用于血清流行病学研究。传统微量中和试验周期长，需要特定的实验室，而Hou W[4]等在此基础上建立了酶联免疫斑点中和试验，缩短试验周期，可用于抗CA16中和抗体测定。ELISA检测血清特异性IgM的方法操作简单，对检测条件要求不高，检测成本相对廉价[5]，可作为有效的检测手段。近几年已被用于临床诊断中,Gao C等[6]人通过基因工程技术分别重组表达了各肠道病毒VP1蛋白，建立ELISA方法并对人群不同肠道病毒感染血清抗体进行检测与分析，描述人群血清流行病学情况。ELISA检测IgM时，由于EV71与CA16以及其他肠道病毒存在抗体交叉反应，而影响检测特异性，在结果分析时需注意[7]。随着分子生物学技术的发展，病毒分子诊断技术应运而生，其中基于CA16病毒VP1基因序列设计的引物和探针已建立了实时荧光定量PCR(Real Time PCR)和RT-PCR，灵敏性和特异性均较高，可检测到数个拷贝的病毒，以及多重联合扩增方法可同时检测CA16 和其他肠道病毒[8]。基因芯片技术(Microchip Assay)对多重病原体联合检测，适用于大样本分析[9]，有力的提高了病毒感染检测的效率，但该技术从核酸提取到结果分析步骤较多，并容易出现交叉污染。本研究利用密度梯度离心法纯化病毒颗粒，免疫小鼠制备抗CA16特异性单抗，并评价单抗在细胞ELISA和免疫化学染色试验中的作用，同时，以单抗为材料建立胶体金免疫层析检测试纸条。

氯化铯密度梯度离心纯化技术纯化CA16病毒颗粒时，由于密度梯度离心后病毒层为白色条带，不易完全回收。因此，在密度梯度离心前将结晶紫加入轻密度梯度液中，在离心力的作用下，病毒颗粒由上层低密度区域向下层高密度区域移动过程中，低密度梯度液中的结晶紫会将病毒颗粒染成蓝色，当病毒到达等密度区域后逐渐形成蓝色病毒区带，这样便于回收病毒层。病毒颗粒电镜下呈现二十面体立体对称球形结构，并可观察到空心病毒颗粒与完整病毒颗粒。另外，蔗糖密度梯度离心技术也可用于CA16的纯化，并可将空心病毒颗粒与完整病毒颗粒分离开[10],CA16与EV71一样，均可用蔗糖密度梯度离心分离成2种不同浮密度的颗粒[11]，但是蔗糖的粘度系数较氯化铯高，离心时间较长。由于本研究主要为了获得病毒抗原，无需将空心病毒颗粒和完整病毒颗粒分开，所以采用氯化铯梯度离心纯化方法。Kattur Venkatachalam AR等[12]通过弱离子交换层析获得高纯度EV71病毒颗粒，除此之外，目前用于肠道病毒纯化的方法还有凝胶过滤与离子交换结合及亲和层析等技术[13-14]，纯化的病毒蛋白纯度高，但回收效率稍低于密度梯度离心。也可先用液相层析系统纯化病毒，然后用蔗糖密度梯度离心纯化，这样将层析技术与密度梯度离心技术相结合，获得病毒颗粒更纯，并可经蔗糖密度梯度离心将空心病毒颗粒与完整病毒颗粒分离，两种方法的结合可显著提高病毒纯度，但病毒回收率与单独层析法相比下降20%[15]，所以，应根据具体要求选择合适的纯化方法。

此次纯化病毒颗粒灭活后免疫小鼠筛选出1株分泌抗CA16特异性单抗的杂交瘤细胞株，mAb CA16-19为IgG2a亚型,效价为10-5。此次制备的mAb CA16-19可用于细胞免疫荧光试验、细胞免疫化学染色试验，可用于CA16病毒感染机制或抗原表位的研究。同时也通过mAb CA16-19 建立了细胞ELISA方法，可在病毒感染RD细胞后24 h进行检测，由于ELISA吸光度值较直接观察细胞病变效应更客观，因此，细胞ELISA可用于快速中和试验。与此同时，利用前期制备的mAb CA16-10标记胶体金，将mAb CA16-19单抗用点膜机喷入反应膜上作为检测线，组装胶体金免疫层析试纸条，并对其敏感性和特异性分析，试纸条可与CA16培养上清特异反应，与EV71和柯萨奇病毒B3不发生交叉反应，最低检测限为6.25×106.25TCID50/0.1mL。因此，该方法较病毒分离、血清学检测和分子生物学检测方法操作简单、快速、准确，无需其他设备进行检测，10 min内肉眼可判定结果，可用于临床快速检测和流行病学现场快速筛查。Zhang J等[16]也用胶体金免疫层析法分别检测抗EV71和CA16的IgM抗体，与PCR和ELISA比较均显示有较高的灵敏度，可用于现场快速检测，但由于病原体较血清抗体出现早，病原体检测对早期筛检略胜一筹。

综上，本研究通过密度梯度离心法纯化出CA16病毒颗粒，成功制备出抗CA16特异性单克隆抗体，该抗体可用于细胞免疫荧光试验、细胞免疫化学试验及细胞ELISA中，并初步建立了胶体金免疫层析检测法，为CA16病原学研究及快速检测提供帮助。由于本中心实验室肠道病毒株种类有限，未能全面进行试纸条交叉反应性分析。下一步还将采集CA16感染患儿咽拭子和粪便样本进行临床样本检测分析，继续优化胶体金试纸条，提高检测灵敏度和特异度，为临床早期诊断和治疗提供重要依据。