分子与血清学检测确诊2017年西非塞拉利昂1例猴痘病毒感染病例

宋敬东赵 莉张 益夏连续祝令伟任 娇王文玲武桂珍田厚文谭文杰

猴痘是由猴痘病毒感染引起的急性人兽共患传染病。猴痘病毒是一种基因组长达200 kbp 左右的DNA病毒，属于痘病毒科正痘病毒属，同一属的病毒还包括天花病毒、牛痘病毒等[1]。猴痘病毒最早是1958年在哥本哈根的实验猴体内分离得到[2]，是一种重要的动物源性感染病原。人感染猴痘病毒后临床症状主要表现为类似天花感染的早期发热类症状，包括发热、头疼、乏力和皮肤出痘等。与天花感染者不同的是，猴痘感染病人有典型的淋巴结相关疾病，可以通过接触感染者伤口和呼吸道传播[3-4]。19世纪70年代以来，随着天花病毒被消灭，已经有不少猴痘病毒感染人类的病例报道。首个猴痘病毒感染人的病例是1971年民主刚果共和国发现并报道的，目前猴痘病例主要分布在非洲中、西部热带雨林地带的国家。2003年，由于进口了西非地区加纳的野生动物，美国有47例猴痘病毒感染病例的报道[6]。近几年在非洲，猴痘病毒感染病例常有报道，刚果(金)2013报道 104例病例，50例被确诊，10例死亡。2016年9月4日至10月7日，WHO在中非报道了26例的确诊病例。从2017年9月4日至12月9日，西非的尼日尼亚有172例疑似病例，其中有61例确诊病例(http://www.who.int)。

2017年3月16日，在塞拉利昂南部普杰洪省，一位35岁的猎人出现发烧、身体疼痛、吞咽困难和淋巴结肿大。3月17日皮肤出痘，进入当地医院治疗。分别于3月28日(出现症状后12 d)和5月10日(出现症状后55 d)，采集病人的血清进行实验室检测。本文对该病人的血清样本分别进行核酸和血清学检测，结合临床学特征和病人野生动物接触史，确诊该病人为猴痘病毒感染。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1送检样本 疑似病人感染后第12 d、55 d血清，由塞拉利昂卫生部采集并提供相关流行病学信息，样本按不明原因发热出疹送中塞友好生物安全实验室进行Zika与Ebola病毒检测(检测结果皆为阴性)。样本灭活及核酸提取皆在塞拉利昂-中国友好生物安全三级实验室操作。

1.1.2引物、探针与多肽 猴痘特异性引物是针对MPXV F3L 基因设计[7](D14L)，F3L-F290:5′-CTCATTGATTTTTCGCGGGATA-3′，F3L-R396:5′-GACGATACTCCTCCTCGTTGGT-3′，荧光标记探针为F3Lp333S-MGB：5′-FAM-CATCAGAATCTGTAGGCCGT MGBNFQ-3′，由美国Applied Biosystems Inc合成。DNA提取试剂盒购自Qiagen公司，TaqMan Universal PCR Master Mix 购自Applied Biosystems Inc公司。猴痘特异性多肽(B21R-179-BSA, B21R-185-BSA)参考2005年文献[8]，由中科亚光生物科技公司合成，纯度大于90%。

1.1.3其他实验材料 灭活的痘苗病毒由本科室利用143TK-细胞(ATCC)扩增获得，为痘苗病毒天坛株(TK+)来自卫生部药品生物制品检定所，批号7601。辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG、IgM抗体购自碧云天。96孔板、封闭液、样本稀释液、显色液和终止液均购自北京索莱宝生物科技有限公司。痘苗病毒阳性血清(痘苗病毒天坛株实验室感染者恢复期血清)和阴性血清(正常成年人体检血清)由本科室提供和保存。

1.2 方 法

1.2.1利用real-time PCR对猴痘病毒核酸特异性检测[7]按照QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, USA)的说明书从200 μL 病毒血清中提取DNA。提取好的基因组放置于-70 ℃冰箱保存。实时定量 PCR在 Bio-rad公司的CFX96机器上进行，程序如下:95 ℃,10 min，95 ℃，30 s，60 ℃，60 s，40个循环。 每个反应重复2次，孔板对照的模板为水，阳性对照模板为含有该段基因的质粒(本实验室构建)。

1.2.2正痘病毒IgG和IgM抗体检测[8]用100 μL含有灭活的痘苗病毒的包被液(106PFU)包被96孔ELISA板，4 ℃过夜。以含有0.05% Tween、5%脱脂奶粉、2% BSA和2%山羊血清的PBS封闭ELISA板。将病人血清样本以1∶50～1∶6 400进行倍比稀释后，按照每孔100 μL 加入ELISA板中，37 ℃反应1 h。 PBST洗板拍干后，加入1∶5 000稀释的HRP标记的羊抗人IgG或者IgM抗体，37 ℃反应1 h。PBST洗板拍干后加入TMB底物显色液，反应5 min后加入终止液，用酶标仪测定反应板中每孔液体450 nm 处的吸光度值。将阴性对照的平均值的2.1倍定义为cutoff值，OD值大于或等于cutoff值判定为阳性。

1.2.3猴痘病毒IgG和IgM抗体检测[8]用包被液稀释猴痘特异性多肽(B21R-179-BSA, B21R-185-BSA)至500 ng/mL，100 μL/孔包被，4 ℃过夜。剩余步骤同正痘病毒IgG和IgM抗体检测。

2 结 果

2.1流行病学史 2017年3月16日，一位塞拉利昂南部普杰洪省的35岁猎人出现发烧、身体疼痛、吞咽困难和淋巴结肿大。第2 d，皮肤出现痘状水疱。在出现症状的10 d前，该病人曾去野外狩猎，并食用捕获野生动物。经过住院治疗后，病人逐渐康复。当地医院将16位曾有病人接触史的居民，进行隔离21 d观察，没有疑似感染症状出现。

2.2核酸检测 于3月28日(SL-D12：出现症状后12 d)与5月10日(SL-D55：出现症状后55 d)，分别采集病人的血清进行核酸提取以及猴痘特异性Real-time PCR检测。结果如图1所示，SL-D12的Ct值为35左右(3次实验结果)，SL-D55的检测结果为阴性。

2.3正痘病毒IgG和IgM检测 正痘病毒IgM检测结果，SL-D12血清进行50～200倍稀释后，IgM检测为阳性；SL-D55样本，50倍稀释的IgM为阳性；而正痘病毒IgG检测结果，50～800倍稀释的SL-D12血清检测结果均为阳性，而50～400倍稀释的SL-D55血清检测后均为阳性 (表1)。

2.4猴痘病毒IgG检测 为了进一步判断是否为猴痘病毒特异性IgG，我们以猴痘特异性多肽作为抗原包被ELISA微孔板，检测猴痘特异性IgG水平。50～800倍稀释的SL-D12血清，猴痘IgG结果为阳性，而SL-D55血清稀释至3 200倍，仍为阳性，提示55 d较22 d抗体滴度有4倍升高(表1)。

注：1.阳性对照；2. 样本SL-D12；3.样本SL-D55；每组均设置复孔图1 疑似感染者血清中猴痘病毒核酸检测结果Fig.1 Results of nucleic acid detection to Monkeypox virus of suspected patient

表1 疑似感染者血清ELISA检测结果
Tab.1 ELISA results of sera samples from suspected patient

血清稀释倍数痘苗病毒 IgM 痘苗病毒 IgG 猴痘病毒 IgG SL-D12 SL-D55SL-D12SL-D55SL-D12SL-D55505.222.684.834.7711.4314.261005.211.844.433.96 9.4113.572002.801.293.883.74 6.9711.864001.680.893.682.90 4.5911.048001.350.522.741.59 2.629.041 6000.760.581.520.57 1.846.463 200NDNDNDNDND2.816 400NDNDNDNDND1.34

ND: 未检测。

3 讨 论

猴痘病例主要分布在非洲中、西部热带雨林地带的国家，美国2003年发生猴痘流行，共发现72例疑似病例，47例经实验室证实[6]，大部分病例可能是由于接触了来自动物经销商的进口非洲土拨鼠而感染的动物引起。这是首次发生在非洲大陆之外的猴痘流行，说明在全球一体的贸易和旅游时代，一些罕见的或外来的病原体可以跨越自然疫源区的地理界限而迅速蔓延。我国目前虽无猴痘输入性病例，但在中西非的劳务及援外人员数以千计，且经常往返，随时有病例输入的可能性。因此，我国应该加强痘病毒鉴别诊断新技术储备与研发，为应对可能突发出现的猴痘病毒或其他危害严重的正痘病毒传入与感染流行提供技术支持。

塞拉利昂是一个有超过七百万人口的西非国家，1970年，塞拉利昂出现过1例的猴痘感染确诊病例，之后数十年没有病例的报道[9]。有研究对西非报道的猴痘病毒基因组进行测序、进化树分析及地理分布模型的预测显示，塞拉利昂的南部适合猴痘病毒的传播[10]。1967-1968年起，为了消灭天花，在当地掀起大规模的疫苗接种运动，疫苗接种率达到了80%[11]。而疫苗的接种，会在接种者体内产生抗正痘病毒的保护性抗体，持续数十年之久[12]。有文章通过血清学调查，报道了在塞拉利昂东南部人群中存在正痘病毒IgG和IgM阳性的血清，其中血清抗体阳性多为出生在天花疫苗接种之后，提示该地区存在正痘病毒区域流行情况[13]。

由于当地气候炎热，当地经济水平和基础设施较差，样本的储存和运输存在着困难，目前中塞友好生物安全实验室也没有条件进行病毒分离实验。利用二代测序技术研究猴痘病毒基因组已经成为一种重要的实验方法，猴痘病毒主要存在西非株和刚果株2个不同的基因型[14]。由于本研究得到的样本质量较差，通过二代测序，没能获得完整的猴痘病毒基因组全序列。下一步将利用特异性PCR方法，对在进化树上保守基因组区进行序列扩增克隆分析，研究其进化情况。

猴痘病毒特异性IgG和IgM 血清学诊断方法一直存在困难，特别是cutoff值的确定[15]。本研究利用痘苗病毒作为抗原，进行正痘病毒IgG和IgM检测，结果显示，二者均为阳性，而这是否因为患者曾经接种过天花病毒，需要进一步研究。猴痘病毒特异性多肽作为抗原包被，确定是否存在猴痘病毒特异性IgG和IgM，结果显示在急性期(SL-D12)和恢复期(SL-D55)血清中，猴痘病毒特异性IgG存在超过4倍升高，且有良好的重复性(表1)。而猴痘病毒特异性IgM的方法重复性较差，这与文献[8]报道的类似。由于国内目前尚无猴痘感染病例，本实验室建立的方法也存在不足之处，下一步需要更多的样本进行验证。

本文首次应用猴痘病毒核酸检测和血清学检测的方法确诊了2017年西非塞拉利昂一例临床疑似病人为猴痘病毒感染。同时，也采用猴痘病人感染样本对本实验建立的猴痘病毒检测方法进行了应用验证，下一步将继续密切关注该地区猴痘病毒感染情况，不断优化完善猴痘病毒快速诊断与鉴定技术。