活性酵素对工厂化养殖凡纳滨对虾生长及水质的影响

杨铿，蒋魁，洪敏娜，徐创文，陈海谊，胡晓娟，曹煜成，杨莺莺

(中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部南海渔业资源开发利用重点实验室，广州 510300)

酵素菌(BYM)的研究始于20世纪初期日本柴田欣司氏尝试用微生物发酵化肥。后来日本专家岛本觉进行了深入研究，分离出3类24种有益菌，并按一定比例制成酵素菌原菌。这3类有益菌分别为细菌(Bacteria，B)、酵母菌(Yeast，Y) 和丝状菌(Mold，M)，因此，酵素菌简称为BYM[1]。目前酵素菌技术已经从水产养殖中的应用扩大至净化水质、改良底质、抑制病菌、提高水产动物的抗病能力、提高养殖产量和增加经济效益等领域，是一种很好的调水剂和饲料添加剂[2-3]。

活性酵素以麸皮为主要原料，可通过多种有益微生物共同作用发酵制得，富含乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌等有益菌及多种酶类和有机酸。陈景明[4]在饲料中添加不同浓度的活性酵素饲养中华倒刺鲃(SpinibarbusSinensis)的研究发现，活性酵素能够很好地促进中华倒刺鲃的生长，并对其肝胰脏淀粉酶的最适pH有较大影响。乳酸菌已经在人类食品、养殖动物饲料和动保产品中得到广泛应用，具有促进消化吸收、改善肠道的作用[5-6]。酵母菌发酵产物富含多种酶与营养物质，可被养殖动物吸收利用，加快其生长速度[7-9]，常作为营养物质添加到饲料中。芽孢杆菌能够分解养殖池残饵、死藻和粪便等，并将大分子有机物残渣分解为小分子有机物，供养殖池藻类利用，调节养殖池氨氮含量和亚硝酸氮含量，保持水质稳定[10-12]。

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)又称南美白对虾，原产于太平洋沿岸水域秘鲁北部至墨西哥桑诺拉一带，1988年由张伟权教授引入中国，1994年批量育苗成功[13]。现已成为全国沿海主要养殖品种之一，内陆地区也开始大量养殖，2017年产量已达到108万t，是推动养殖业发展的主要品种之一。目前关于凡纳滨对虾的研究主要集中于基因改良[14-17]和病害防治[18-20]，而关于使用生物发酵技术拌料投喂改善养殖环境和促进生长的研究却少见报道。目前，在凡纳滨对虾的养殖过程中，由水质下降而引发病害爆发的现象较为常见，已经严重影响虾产业的发展。因此，寻求一种有效改善虾产业养殖环境和促进生长的方法非常必要。

本研究将一款由多种复合菌共同发酵而成的固体发酵产品，应用于室内工厂化养殖凡纳滨对虾过程，研究其对养殖池水质的溶解氧(DO)、pH、氨氮含量、亚硝酸氮含量及对虾生长等指标的影响，旨在探讨有效促其生长并可调节水质的养殖方式，为促进凡纳滨对虾养殖产业的稳定发展提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

主要仪器包括：美国YSI Pro Plus手持式多参数水质分析仪(美国YSI仪器公司)；AL204 型电子秤(美国丹佛仪器公司)；HACH DR/2400型分光光度计(美国HACH公司)。

活性酵素：采用固体发酵技术，以麸皮为主要原料，通过多种有益微生物共同作用发酵所得，富含乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌等有益菌和蛋白酶、淀粉酶、氨基酸、有机酸等有益活性物质，由广州市欣海利生生物科技有限公司提供。

实验用虾苗：0.8 cm凡纳滨对虾小虾苗，800 m2室内工厂化水泥池9个，由广东冠利达海洋集团提供。

1.2 方法

实验过程在室内工厂化水泥池进行，实验周期为45 d。每个水泥池面积为800 m2，水深1 m，每池的投苗量为30万尾，共使用9个养殖池(1个对照组和实验组A、B，每组3个平行实验)。每日投喂餐数为3餐，时间分别是06：00，11：30，17：00。根据对虾生长阶段不同，相应地改变投料比例，即分别使用不同的饲料(0号料、1号料和2号料)：在养殖前15天, 对照组和实验组A、B均投喂0号料；在第16～40天, 对照组和实验组A、B均投喂1号料；在第40～45天, 对照组和实验组A、B均投喂2号料。自虾苗入池第2天开始投喂0号虾苗专用料，每日3餐，按照每餐每10万尾投喂1 kg的标准进行，取每餐投料总量1%饲料放在料台上，用于判断对虾吃料情况，其余部分投喂到整池中。若虾苗在1.5 h内把料台的1%量全部吃完，每餐即增加投料量5%；若未在1.5 h内把料台的1%量吃完，则不增加投喂量。实验组为在饲料总量不变的情况下饲料拌酵素投喂，比例见表1。

表1 试验分组设计Tab.1 Test grouping design

注：0号料酵素和饲料的质量比为1∶1，1号料酵素和饲料的质量比为1∶4，2号料酵素和饲料的质量比为1∶8。

1.3 生长指标测定

每15天于每个池塘中随机抽取30尾虾，将虾置于滤纸上，吸干水分，再用直尺及电子天平称量其体长、体重。

式(1)

1.4 水质指标测定

常规水质检测：每天利用YSI水质检测仪检测养殖池水温、DO、pH值等指标。

氨氮含量、亚硝酸氮含量检测：每3天采集对虾养殖池水样，在养殖池四角及中间位置设5个采样点，采取水面下50 cm水样，将5个水样混匀后，经0.45 μm滤膜过滤，使用HACH速测法(rapid detection method，RDM)进行检测，以HACH分光光度计为检测平台，使用HACH配套试剂包，检测对虾养殖池水体氨氮含量和亚硝酸氮含量[21]。

1.5 数据处理

实验数据均以平均值±标准误(Mean±SD)表示，用SPSS22.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，两组间使用LSD法比较，P<0.05 表示差异显著[22]。

2 结果分析

2.1 对虾生长情况

活性酵素拌料投喂对凡纳滨对虾生长的影响如图1所示，对虾初均重为(0.08±0.01)g，投喂45 d后，对照组终均重为(0.47±0.01)g，而实验组A、B终均重分别是(0.84±0.02)g和(0.65±0.01)g，2个实验组的终均重均显著高于对照组(P<0.05)。实验组A(962.02±13.55)%和实验组B(726.58±16.04)%的增重率均显著高于对照组(498.73±17.38)%(P<0.05)；实验组A和B的体长分别为(5.50±0.14)cm和(4.70±0.15)cm，均显著高于对照组(4.00±0.20)cm(P<0.05)。添加活性酵素的实验组A、B在终均重、增重率和终体长均显著高于对照组(P<0.05)，且实验组A显著高于实验组B(P<0.05)。活性酵素本身富含营养，经对虾摄食后，其所富含的乳酸菌、酵母菌能促进对虾的消化吸收，有利于提高饲料转化率，加快对虾的生长速度。

图1 活性酵素对凡纳滨对虾生长的作用(n=3)A:增重率；B：终均重；C：终体长。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。误差线仅代差异性，标准误请见具体数值。Fig.1 Effect of active enzyme on the growth of Litopenaeus vannamei(n=3)A:Weight gain rate；B：Final average weight；C：Final average length. Different lowercase letters indicate statistically significant differences(P<0.05).Error bars only represent differences, standard error of mean are given in specific values.

2.2 养殖池水氨氮、亚硝酸氮含量分析

如图2所示，对照组水中氨氮含量变化幅度大，在实验开始的第3天，氨氮含量高达(2.70±0.03)mg/L，随后氨氮含量也起伏波动明显，超出0.5 mg/L的安全浓度水平[23]，说明水质不稳定。而2个实验组A、B在整个45 d的实验周期中，氨氮含量在前3天内升高至(2.11±0.03)mg/L，后下降并一直处于低于0.5 mg/L的安全浓度范围内，表明水中氨氮含量相对稳定。在对养殖池开始投料后，养殖池中残饵、粪便等有机质增多，而养殖前期养殖池藻类及有益菌数量较少，尚不能完全分解利用养殖池残饵粪便等，且养殖池前期未换水，造成养殖池氨氮含量较高。随着实验组活性酵素的使用，有益菌形成优势，开始分解利用养殖池中的大量有机物，从而稳定了养殖池氨氮含量。在12～45 d期间，2个实验组氨氮含量稳定，且显著低于对照组(P<0.05)，实验组A、B间无显著差异(P>0.05)。

对照组水中亚硝酸氮含量呈现明显的上升趋势，养殖6 d时，亚硝酸氮含量为(0.12±0.01)mg/L，稍高于安全浓度(0.1 mg/L)；养殖12 d后，亚硝酸氮含量达到(0.23±0.01)mg/L，随后下降，但在养殖27 d时，达到另一个高峰(0.31±0.01)mg/L；整个实验过程内，自第6天起，亚硝酸氮含量持续高于0.1 mg/L的安全浓度水平[23]。当养殖池亚硝酸盐含量高时，为保证对虾健康，养殖企业会采取适当的措施降低亚硝酸氮含量，故而出现含量暂时降低的趋势，但随着养殖时间的延长，对照组养殖池水中的亚硝酸氮含量总体呈现波浪式上升趋势。而2个实验组全程亚硝酸氮含量均无明显波动，始终低于0.1 mg/L的安全浓度(图2)。若养殖池中存在大量死藻、残饵等残留物，会导致养殖池氨氮含量升高，经过养殖池中进一步氧化后生成亚硝酸氮，从而影响养殖正常生长，造成养殖动物中毒[24]。本实验中，投喂含活性酵素的实验组所在养殖池水中亚硝酸含量始终低于对照组，且维持在低于安全浓度(0.1 mg/L)的范围内，说明活性酵素能够分解养殖池死藻、残饵等，有助于调节养殖池亚硝酸含量，稳定水质。

2.3 养殖池水温度、溶解氧、pH分析

结果显示，3组养殖池DO都处于10～13 mg/L的高浓度水平，温度范围为19～23 ℃，pH为7.5～8.4。实验期间，对照组与实验组的此3项重要指标均处于对虾最适生长范围内(图3)，因活性酵素所含乳酸菌、酵母菌，生长代谢不消耗或少消耗养殖池中氧气，拌料投喂量少，产酸较少，故对养殖池DO、pH无显著影响。

图2 活性酵素对养殖池氨氮含量(A)和亚硝酸氮含量(B)的影响(n=3)Fig.2 Effects of active enzyme on ammonia nitrogen(A) and nitrite concentration(B) in the pond(n=3)

3 讨论

3.1 适量活性酵素促进凡纳滨对虾的生长

在水产和畜禽养殖中，酵素菌已广泛应用在饲料添加剂和拌料投喂中，可有效改善养殖动物肠道环境、促进消化吸收并提高其摄食率[25]。杨涛等[26]开展了利用酵素菌技术降低养虾成本、缩短养虾周期的研究，实验发现，养虾饵料系数为0.52时，比一般养虾饵料系数降低50%；养殖周期为60 d，达到比常规养虾时间缩短一半的效果，说明酵素菌可有效促进对虾快速生长。本研究中，对照组养殖池水质不稳定，对虾生长速度相对较慢；而当使用活性酵素拌料投喂凡纳滨对虾时，拌料2餐和拌料3餐的两个实验组的终均重、增重率和终体长均显著高于对照组，促生长作用显著，且拌料2餐对促进凡纳滨对虾生长效果最好。究其原因，可能是在拌3餐酵素时，对虾摄食到的饲料蛋白过少，不足以满足对虾生长需求；而拌料2餐酵素时，对虾既可摄食到足够的蛋白，满足自身生长所需，添加的活性酵素又能够促进对虾消化吸收，因此对凡纳滨对虾的生长表现出较好的促进作用。活性酵素经实验检测含有大量的乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌，乳酸菌含量为9×108cfu/g，酵母菌含量为3.5×106cfu/g，芽孢杆菌含量为4×107cfu/g，粗蛋白含量为 9.55%。这些有益菌被对虾食用后，可在对虾肠道内形成有益菌优势，抑制有害菌生长，降低发病率[27]。发酵后的产物富含虾青素、蛋白酶、淀粉酶和氨基酸等有益活性物质，可促进消化吸收，加快对虾生长速度[2]。

3.2 活性酵素具有调节改善养殖池水质的作用

工厂化养殖是指采用自动化或半自动化的室内高密度养殖系统，通过一系列的措施控制各项水质因子，以达到保持水质稳定，提高产量、降低风险的目的[28-29]。相比于传统外塘大水面低密度养殖的时间长、效益低等不足，工厂化养殖模式更科学、环保和稳定，且经济效益更好[30]，是一种可持续发展的优良养殖模式[31]。但工厂化养殖对虾，在养殖过程中养殖池中产生的氨氮、亚硝酸氮含量一直是阻碍养殖成功率上升的主要因素。水产养殖对于氨氮含量的要求是低于0.5 mg/L，亚硝酸氮含量低于0.1 mg/L，在此条件下对虾能健康生长，超过这个含量水平，对虾即会出现厌食、活力下降及亚硝酸氮中毒等现象，严重时会造成对虾大量死亡。目前各种除氮措施纷呈，效果存在差异[32]。水体环境质量下降是引起各种病害发生的主要因素，因此，提高养殖成功率必须从根本上改善养殖池环境[33-35]。

图3 活性酵素对养殖池DO(A)、温度(B)和pH值(C)的影响(n=3)Fig.3 Effects of active enzyme on DO (A), temperature (B) and pH in the pond (C)(n=3)

凡纳滨对虾最适生长的环境是：pH为7.2～8.8，DO高于4.0 mg/L，氨氮含量低于0.5 mg/L，亚硝酸氮含量低于0.1 mg/L[13]。DO过低、氨氮或亚硝酸氮含量过高都会造成对虾厌食、中毒，引发肝胰脏坏死等，严重时会造成对虾死亡[13]。本研究中，将活性酵素应用到养殖池，能够稳定养殖池的pH值于7.5～8.4范围之间，3组养殖池DO均处于10～13 mg/L的高浓度水平，对DO无明显影响，这与何沅滨等[36]研究芽孢杆菌在养殖养殖池中对水质的影响结果相似。活性酵素是多种有益菌共同发酵后产物，拌饲料投喂，对养殖池的DO无明显的影响，能稳定养殖池pH，改良水质。

氨氮和亚硝酸氮含量是直接影响对虾健康的重要指标，氨氮和亚硝酸氮含量过高，会引起对虾中毒，吃料慢，甚至死亡的情况[37-38]。在养殖的45 d内，对照组氨氮、亚硝酸氮含量不稳定，超出安全浓度范围，分别高达(2.70±0.03)mg/L和(0.31±0.01)mg/L；而使用活性酵素的A、B实验组，水中亚硝酸氮含量均未出现过高浓度，一直保持在安全质量浓度0.1 mg/L内。氨氮含量在最初3 d升高后，随着活性酵素的使用而迅速降低，保持在安全质量浓度范围0.5 mg/L内，实验组A和B对养殖池水氨氮、亚硝酸氮含量的影响无明显差异。活性酵素富含乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌，对氨氮和亚硝酸氮含量具有显著的缓解作用，可稳定养殖池水质[39]。活性酵素拌料投喂到养殖池，部分被对虾摄食到体内，促进消化吸收；部分溶解到养殖池中，补充养殖池有益菌，形成有益菌优势，故能改善养殖池水质环境。活性酵素中有益菌及有益活性物质在拌料投喂中具体的溶失量，及其对水质参数的影响有待于进一步研究探讨。

4 结论

本研究表明，在养殖密度低于375尾/m3的室内养殖养殖池中，每天投喂3餐，早晚拌料2餐活性酵素，可显著降低水中氨氮、亚硝酸氮含量，能够调节改善水质，并能够显著增加凡纳滨对虾的体重和体长，对凡纳滨对虾的促生长作用明显。综上，活性酵素是一种新型的固体生物发酵产物，是水产养殖业安全、健康和高效的水产动保产品。