黄芪多糖对人红白血病K562细胞凋亡的影响

【摘 要】目的：探讨黄芪多糖（简称APS）对人红白血病K562细胞凋亡产生的影响。方法：经流式细胞术来研究APS对人红白血病K562细胞凋亡产生的影响，而APS在K562细胞之中对Caspase-3产生的影响可通过Caspase-3活性测定法进行检测;经Western blot以及RT-PCR对对照组（K562细胞）及APS组（通过200mg/L的APS进行48h诱导形成的K562细胞）之中的Bcl-XL、Bcl-2、IAP-1、Bax、Smac mRNA和蛋白进行表达。结果：APS组细胞凋亡数量相较于对照组更高，两组有显性差异，有统计学意义，P<0.05;APS组K562细胞中的Caspase-3相较于对照组明显增加，但IAP-1及Bcl-2的mRNA和蛋白的表達都显示降低，而Smac以及Bax的mRNA和蛋白的表达均明显增加，两组有显性差异，有统计学意义，P<0.05;两组在Bcl-XL的mRNA和蛋白方面的表达无显性差异，无统计学意义，P>0.05。结论：APS对人红白血病K562细胞进行诱导凋亡可能是通过对Smac、Bax上调以及对IAP-1、Bcl-2下调来实现的。

【关键词】黄芪多糖;人红白血病;K562细胞;凋亡

白血病是一种常见的恶性肿瘤，此症使人类健康受到严重的威胁，白血病细胞在生长的过程中具有凋亡受阻、增殖失控以及分化障碍等特点[1]。而APS属于黄芪的活性成分之一，其具有抗应激、降血压、降血糖、强心以及抗病毒等功效，相关研究表明[2]APS能够有效抑制多种恶性肿瘤，为了研究APS对人红白血病K562细胞凋亡的影响，本次研究通过试验检测对APS组和对照组中的Bcl-XL、Bcl-2、IAP-1、Bax、Smac mRNA和蛋白进行表达，目的旨在研究APS对白血病治疗的依据，现做如下报道。

1 一般资料以及主要方法

1.1 一般资料

1.1.1 细胞来源和培养

K562细胞主要来源于本地细胞库，通过使用10%（体积分数）的胎牛血清（简称FBS）、100mg/L链霉素以及100U/mL青霉素所形成的RPMI培养基参与细胞培养，并置于5%（体积分数）的CO2培养箱之中进行细胞培养，培养箱温度为37℃。

1.1.2 试剂

（1）FBS：杭州四季青有限公司生产;

（2）Trizol试剂、RPMI培养基以及100bp DNA Marker：美国Invitrogen公司生产;

（3）Taq DNA聚合酶、RT-PCR试剂盒、dNTPs：日本TAKARA公司生产;

（4）Annexin V-FITC/PI：碧云天生物科技有限公司生产;

（5）化学发光试剂盒：美国Santa Cruz公司生产;

（6）Colorimetric试剂盒、CaspACETM Assay System试剂盒：美国Promega公司生产。

1.2 实验检测

1.2.1 细胞凋亡检测

收集对照组（K562细胞）及APS组（通过200mg/L的APS进行48h诱导形成的K562细胞）样本，并对细胞数量进行计量。通过195μL的Annexin V-FITC结合也将收集的细胞进行重悬，然后向其中加入5μL的Annexin V-FITC，进行10min的避光孵育，离心5min，1000r/min，去除上清。并通过190μL的Annexin V-FITC再次对细胞进行重悬，然后向其中加入10μL的染色液（碘化丙啶），并于冰上对其进行避光孵育，然后通过上流式细胞仪完成凋亡细胞数量的计量。实验的过程中需要设置3个平行样本。

1.2.2 Caspase-3活性测定

将APS组和对照组中的K562细胞总蛋白进行提取，并对其进行定量。然后进行Caspase-3活性测定，测定方法需严格按照说明书规定操作，并将相应试剂依次加入到96孔板中使反应混合物得以制备完成。两组各设3个复孔，并设置空白对照孔（不加蛋白）。然后向每孔加入2μL的AC-DEVA-PNA底物，避光培育，温度设定为37℃，时间设定为4h，并对405nm位置的光密度值进行测定，同时将各组的平均值进行计算，将各组所得平均值检出空白对照平均值所形成的差值来对Caspase-3活性进行表示。

1.2.3 Western blot及RT-PCR检测

（1）Western blot检测：将两组K562细胞总蛋白进行提取，同时进行定量，应用Western blot法进行检测。将β-actin当做内参照。上样量设定为100μg，Bcl-XL、Bcl-2、Bax、IAP-1、Smac、β-actin克隆抗体的稀释度分别为100倍、150倍、150倍、100倍、150倍。并通过软件对目的条带同内参照条带之间的灰度比值进行分析。

（2）RT-PCR检测：将两组K562细胞总RNA进行提取，同时进行定量，完成cDNA第一条链的体外合成，并将cDNA当做模板来完成PCR反应，然后使用软件对PCR扩增物的目的条带同内参照条带之间的灰度比值进行分析。

1.3 观察指标

本次研究选择的观察指标为Caspase-3、Bcl-XL、Bcl-2、IAP-1、Bax、Smac mRNA和蛋白。

1.4 统计学方法

此次研究在数据统计方面使用的软件版本为SPSS20.0，以（）表示计量资料，采用t检验，以率（%）表示计数资料，采用X2检验，当显性差异出现时，有统计学意义，P<0.05。

2 结果

2.1 APS对人红白血病K562细胞凋亡产生的影响

通过检测，APS组中K562细胞凋亡数量为（3319.00±408.64）个，相较于对照组（104.84±19.17）个更多，两组有显性差异，有统计学意义，P<0.05，t=14.2831。

2.2 APS对Caspase-3产生的影响

APS组Caspase-3活性为（0.349±0.032），相较于对照组Caspase-3活性（0.092±0.011）更高，两组有显性差异，有统计学意义，P<0.05，t=4.7436。

2.3 APS对Bcl-XL、Bcl-2、IAP-1、Bax、Smac表达产生影响

如表1～2，APS组K562细胞中的IAP-1及Bcl-2的mRNA和蛋白的表达相较于对照组都显示降低，而Smac以及Bax的mRNA和蛋白的表達均明显增加，两组有显性差异，有统计学意义，P<0.05;两组在Bcl-XL的mRNA和蛋白方面的表达无显性差异，无统计学意义，P>0.05。

3 讨论

常规下细胞凋亡及增殖之间达到动态平衡时，可对机体稳定性进行维持，而凋亡和增殖一旦出现失衡，将可能造成肿瘤产生[3]。而细胞凋亡受基因调控的影响较大，其中，Caspase家族便是关键分子，Caspase家族成员一般都具备半胱氨酸蛋白酶活性，Caspase-8以及Caspase-9在凋亡途径中处于上游位置，而Caspase-3则属于凋亡效应因子，Caspase家族形成的级联激活共同导致细胞凋亡出现[4]。

对于Caspase家族激活方面，Bcl-2家族在对其激活过程中能够发挥调控作用，其属于一种蛋白因子，在参与细胞凋亡调控过程中，具体以线粒体这一途径来实现调控的[5]。从Bcl-2家族在细胞凋亡方面发挥的作用来看，其家族蛋白通常可分两类，分别为促进凋亡蛋白（Bax等）和抑制凋亡蛋白（Bcl-XL、Bcl-2等），后者能够对细胞出现的凋亡进行抑制，从而使细胞的寿命得到延长，而前者则能够使Caspase家族得以激活，从而造成细胞凋亡产生[6]。此外，还有研究表明[7]，Smac能够同IAPs之间进行结合从而使Caspase得以释放，最终促进细胞凋亡;而XIAP、Livin则能够使Smac释放减少，从而使细胞凋亡被抑制[8]，为此，此次研究特将上述指标加入到研究之中，以明确APS对K562细胞凋亡发挥的机制影响。

本次研究中，APS组细胞凋亡数量多于对照组，且APS组K562细胞中的Caspase-3相较于对照组明显增加，但IAP-1及Bcl-2的mRNA和蛋白的表达都显示降低， Smac以及Bax的mRNA和蛋白的表达均明显增加，两组有显性差异，有统计学意义，P<0.05;两组在Bcl-XL的mRNA和蛋白方面的表达无显性差异，无统计学意义，P>0.05。此结果能够与上述机理对应，说明APS可对K562细胞凋亡产生重要影响。

综上所述，APS对人红白血病K562细胞进行诱导凋亡可能是通过对Smac、Bax上调以及对IAP-1、Bcl-2下调来实现的。

参考文献

[1]张海兵，辛勇，唐天友等.低剂量照射对人红白血病细胞株 K562凋亡、Bcl-2、Bax及p53蛋白表达影响的实验研究[J].中国医刊，2015（09）：65-69.

[2]罗昊，孟赞，刘泽洪等.阿糖胞苷通过自噬途径影响K562细胞增殖凋亡的实验研究[J].重庆医学，2017（13）：14-17.

[3]孙华丽，洪其军.X射线照射后Rac1蛋白对慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡的影响[J].医学信息，2014（13）：46-47.

[4]王淡瑜，刘泽林，金梦迪等.PKF118-310对白血病K562细胞凋亡的影响及其机制[J].白血病·淋巴瘤，2016，25（06）344-348.

[5]魏万敏.大蒜素对人白血病细胞系K562细胞增殖和凋亡的影响[J].医学美学美容旬刊，2014（07）：141-141.

[6]张帅帅，鲜敬荣，邹琴等.敲低TRAF6对白血病K562细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制[J].中国细胞生物学学报，2015（12）：1659-1665.

[7]封蔚莹，周炀，刘忠民.高三尖杉酯碱联合survivin抑制剂YM155对人白血病K562细胞系增殖和凋亡的影响[J].临床血液学杂志，2015（02）：209-211.

[8]廖琼，孙玉梅，姜夏薇等.DBO对人慢性髓系白血病细胞K562增殖和凋亡以及自噬影响[J].中华肿瘤防治杂志，2017（19）：1342-1348.

作者简介

赵淑敏（1990-），女 ，山东省菏泽市人。住院医师。研究方向为血液内科。