用吖啶橙-流式细胞仪技术检测间苯二胺、对苯二胺诱导的小鼠骨髓细胞微核率

陈秀娟, 江 漪, 李 敏, 李培宁, 孙 侠, 陈梓灵, 丘智峰, 黄宇锋

(广州质量监督检测研究院, 广州 511447)

微核(Micronucleus)也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。应用小鼠骨髓红细胞微核试验 (Micronucleus test)是一种能获得大量客观数据的遗传毒性试验方法之一，该方法简便、易行、经济, 因而被广泛采用, 但传统的微核计数是实验人员借助显微镜完成的, 方法枯燥、耗时, 易受实验者主观因素影响, 而且 Giemsa染色法特异性较差, 非特异着色颗粒有时很难与微核相区别，影响实验结果判断。近年来流式细胞术在细胞学、临床医学、生物学、制药学和微生物学等多个领域中得到广泛应用[1-4], 本文参照有关文献[5-7], 利用小鼠骨髓细胞经吖啶橙(acridine orange, AO)荧光染色, 采用单激光流式细胞仪(flow cytometer, FCM)检测骨髓细胞中含微核的嗜多染红细胞(micronucleated polychromatic erythrocytes)和含微核的成熟红细胞(micronucleated normochromatic erythrocytes)，通过与传统 Giemsa人工显微镜检测法(Giemsa人工法)比较，建立AO-FCM自动化微核试验，探讨FCM在化妆品原料致突变性检测中的应用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级 雌性KM小鼠50只, 体质量 20～25 g，由山东省济南朋悦实验动物繁育有限公司提供[SCXK(鲁) 2014-0007]。饲养于本单位屏障环境动物设施[SYXK(粤)2014-0137]。实验小鼠检疫合格后随机分组，每组5只。实验过程中所有动物在同等条件下饲养，自由饮水、摄食。

1.2 试剂与仪器

间苯二胺(MPD)、对苯二胺(PPD)[3]均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司, 其中PPD规格： 100 g/瓶，纯度＞99%，批号： H1829001, MPD规格： 100 g/瓶，纯度＞99.0%，批号： J1815296。环磷酰胺 (CP) 和(AO 均购自上海源叶生物科技有限公司; TritonX-100购自美国 Sigma公司; 小牛血清购自美国 Gibco 公司; 0.9%氯化钠溶液(NS)购自山东化鲁制药有限公司; 其余均为国产市售分析纯试剂。

CytoFLEX FCM购自美国 Beckman 公司; Axio Lab A1 显微镜购自德国蔡司公司; KDC-1044 低速大容量离心机购自安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 试剂配制

固定液： 十二烷基硫酸钠(SDS) 3 mg + 0.05 mol/L,pH 6.8 Sorensen's 缓冲液 99 mL + 戊二醛 1 mL。

溶液A： Triton X-100 0.05 mL + 1.0 mol/L HCl 4.0 mL+ NaCl 0.4385 g，加水至 50.0 mL。

溶液B： 0.1 mol/L 柠檬酸溶液 37 mL + 0.2 mol/L Na2HPO4溶液 63 mL + NaCl 0.877 g + EDTA-Na20.034 g + 1 mg/mL AO 0.6 mL。

1.4 药物处理

受试物剂量组分别以25.0 mg/kg、12.5 mg/kg、6.25 mg/kg和3.12 mg/kg剂量[7]腹腔注射MPD或PPD。阳性对照组腹腔注射40 mg/kg 的CP, 阴性对照组给予同等容量生理盐水(NS)。注射量均为10 mL/kg, 24 h后以同样的剂量进行第2次染毒。

1.5 AO-FCM法

于末次染毒 6 h 后处死小鼠，分离双侧股骨，用注射器吸取400 mL 小牛血清将骨髓冲出，反复冲洗吹打，制成细胞悬液。取2.5 mL 固定液于离心管中，在振荡混悬仪下边振荡边加入100 mL细胞悬液，固定5 min，1 250 r/min 离心5 min，去上清，细胞沉淀重新混悬于100 mL 0.06 mol/L、pH 7.2的 Sorensen's 缓冲液中。溶液A与溶液B在使用前置于0 ℃冰箱放置2 h，使溶液保持低温，加入 200 mL 溶液A与 800 mL 溶液 B，混匀，置于冰上避光染色 30 min。1 250 r/min 离心 5 min，去上清，细胞沉淀重新混悬于2.5 mL 0.06 mol/L、pH 7.2 Sorensen's 缓冲液中，用FCM进行测定。

FCM 的主要参数： 前置角(0°)散射光(FSC)，侧向角(90°)散射光(SSC)。DNA 荧光(FL1，绿色,525 nm)，刻度设置为对数; RNA荧光(L4，红色，675 nm), 刻度设置为线性。采集速度控制在1 500± 500个细胞/秒。每个样本采集200 000个细胞进行分析。利用 FCM自带软件CytExpert 2.2 的分区功能, 去除有核细胞(Nucleated cells, NC), 把 PCE、MNPCE、成熟红细胞(NCE)、MNNCE 划分为4个区, 计算骨髓嗜多染红细胞微核率(fNMPCE)、骨髓成熟红细胞微核率 (fMNNCE)、PCE/NCE。

1.6 Giemsa 人工法

对传统的 Giemsa 染色法进行了适当的改进： 把上述剩余的骨髓细胞悬液以 1 000 r/min 离心 5 min，去上清，细胞沉淀重新混悬于40 mL 血清中，取15 mL 制成骨髓细胞涂片, 凉干后, 甲醇固定 15 min,以 pH 6.8 Sorensen's 缓冲液配成浓度为 10% 的Giemsa染液，常温下染色 40 min，用纯净水冲洗，再用 0.004 % 柠檬酸润洗数秒后, 马上用纯净水冲洗，凉干，用环保封片剂进行封片，镜检。每只小鼠分别记数 1000个PCE，计数MNPCE，计算 fMNPCE ，以千分率表示。同时计数 200个PCE时所见的NCE数，计算 PCE/NCE。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 AO-FCM 法检测小鼠骨髓 fMNPCE、fMNNCE、PCE/NCE

用FCM前置角散射光(Forward angle scatter，FSC) 和 DNA 荧光(DNA fluorescence，FL1) 作二维散点图，可以明显看到细胞样本区分为5 个群：NC(P1)、PCE(P2)、MNPCE(P3)、NCE(P4)、MNNCE(P5)。NC与红细胞分界清楚，PCE与NCE分界也较为清楚，PCE与MNPCE、NCE与MNNCE的分区有明显的分界趋势。与阴性对照组比较，CP处理组的有核细胞密度下降，MNPCE及MNNCE 区域的细胞密度明显增加，而阴性对照组的MNPCE及MNNCE所在区域未见明显的细胞群。CP处理组与阴性对照组比较，fMNPCE、fMNNCE升高有显著性差异 (P＜0.01)。MPD和PPD各剂量的 MNPCE 及 MNNCE 区域的细胞密度明显增加，而且细胞密度随着浓度的加大而增加，有剂量-反应关系(图1)。且MPD和PPD各剂量的 fMNPCE、fMNNCE与阴性对照组比较有显著升高(P＜0.01)。PCE/NCE＞1.0，显示MPD和PPD未对小鼠骨髓有抑制作用(PCE/NCE＞1.0)(表1)。

2.2 Giemsa人工法 检测小鼠骨髓 fMNPCE、fMNNCE

细胞涂片 Giemsa 染色后，经 0.004 % 柠檬酸润洗数秒，在显微镜下观察，PCE为灰蓝色，NCE呈淡黄或橘黄等鲜艳明亮的颜色，MN呈圆形或椭圆形，边缘光滑整齐，呈紫红色或蓝紫色。玻片的背景清楚，PCE与 NCE有明显的颜色差别，易于辨认。MPD和PPD各剂量的 fMNPCEE、fMNNCE 有明显有升高，与阴性对照组比较有显著性差异(P＜0.01)。PCE/NCE＞1.0，显示MPD和PPD未对小鼠骨髓有抑制作用(表2)。

2.3 AO-FCM 法与 Giemsa 人工法检测小鼠骨髓微核结果的比较

分析比较两种方法的fMNPCE, 无论是AO-FCM法还是 Giemsa人工法均显示MPD、PPD诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的升高, 结果一致。AO-FCM法检测结果略高于Giemsa人工法检测结果，但经SPSS 22 .0分析显示，二者间具有良好的相关性，相关系数为r =0.956, P＜0.01[10]。

表1 用 AO-FCM 法检测小鼠骨髓的 fMNPCE、fMNNCE、PCE/NCE

图1 小鼠骨髓细胞群在FCM检测窗口的分布图

表2 用 Giemsa 人工法检测小鼠的骨髓 fMNPCE, PCE/NCE

3 讨论

苯胺类物质作为氧化型染发剂中最常见的染料，其中常用的MPD和PPD 均会对人体产生一定的危害[10-12]，是国际公认的一种致癌物质[13]。

随着FCM检测技术的完善，流式细胞术在微核试验的检测方面有了长足的进步。国内外研究报道，目前已建立了大鼠、小鼠的骨髓嗜多染红细胞微核的FCM检测方法。本实验在以往文献报道的研究基础上，用AO染色，采用单激光FCM检测了小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率，探讨此方法用于化妆品原料的遗传毒性筛选和遗传毒性评价的可能性。经 AO染色，PCE含RNA被染成橘红色，含DNA的细胞核及微核被染成黄绿色，而 NCE不含DNA也不含RNA，不被染色，所以显示为暗影。理论上，可利用FL1(黄绿色荧光，指示 DNA)或者 FL4 (红色荧光，指示RNA)区分PCE与NCE。本实验发现，FL4不能把PCE与NCE区分开，而FL1 则能很好地对其进行区分，但 FL1不能把含微核的细胞与不含微核的细胞区分出来，本实验利用FL1 结合 FSC (指示细胞大小)，则能把细胞样本区分为5个群： NC、PCE、MNPCE、NCE、MNNCE。本实验结果显示： FCM在检测fMNPCE的同时可检测fMNNCE，从FCM检测窗口的分布图可见 MNNCE 区域的细胞密度，随着剂量升高也有不同程度的增加，且有剂量-反应关系。fMNNCE是否也可能作为监测遗传损害的生物学指标之一呢？非常值得今后更进一步深入研究。

本实验采用AO-FCM法检测出的小鼠骨髓fMNPCE稍高于 Giemsa 染色人工显微镜检测值。初步分析原因如下： ①可能是个别红细胞产生了较强的自发荧光，造成结果偏高; ②可能是部分体积较大的PCE被误认为含微核的PCE，而导致假阳性的出现; ③可能是 Giemsa人工法只计数1 000个PCE，样本量少而容易出现漏判，导致假阴性结果。虽然用AO-FCM检测存在有假阳性的可能，但流式细胞术检测的细胞数是几十万个甚至是更多的细胞，Giemsa人工法一般只是计数1000至2000个PCE，流式细胞术检测细胞数量巨大，对最终检测结果的影响仍是有限的。Giemsa人工法中，实验人员在显微镜中依靠细胞显示的染色判别 PCE、NCE、MNPCE和MNNCE，理论上PCE呈灰蓝色，NCE呈桔红色，MN呈紫红色，但是 Giemsa 复合染料中往往含有嗜天青颗粒，很难与MN区别，而且 PCE与 NCE细胞之间并没有明显的区分界限，显微镜下仍难以将两者完全区分; 同时不同的实验人员或不同的实验室之间并无一致的评判标准，这些因素都会影响结果的判断。

综上所述，本实验结果表明 AO-FCM自动化微核检测体系可替代人工显微镜，用于小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的检测。