套环法和空气干燥法建立兔颈动脉粥样硬化斑块模型的比较分析

王 琮, 陈筱雪, 杨少玲, 王凤翎, 范林艳, 贺倩倩

(安徽理工大学附属上海市奉贤区中心医院, 上海201400)

脑血管意外是全球发病率和死亡率最高的疾病之一, 研究[1]表明易损斑块和急性脑血管意外有明显关联, 是脑缺血高发生率的重要原因。多数的急性脑血管意外是动脉粥样硬化易损斑块破裂和继发血栓所致。因此，易损斑块的特性及干预斑块破裂导致的一系列病理生理过程成为当前的研究热点。有关粥样硬化易损斑块的组织学研究主要依赖动物模型，由于兔在脂蛋白代谢方面与人有相似之处，且对血脂的清除能力低，进食含高胆固醇饲料后，短时间内可形成高胆固醇血症，容易产生动脉粥样硬化斑块。因此，兔常用于构建动脉粥样硬化易损斑块动物模型。但有研究[3,4]指出单纯给予兔高脂饮食，其产生的动脉斑块更偏向于黄瘤病，而非类似于人动脉粥样硬化斑块。所以我们试图通过不同方法来建立兔颈动脉粥样硬化模型，寻找更高效的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级雄性新西兰白兔20只，3～5月龄, 体质量2.0～2.5 kg，购自上海奉贤腾达兔业[SCXK(沪)2014-0003]，饲养于上海市奉贤辉煌实验动物养殖场[SYXK(沪)2013-0047]。高脂饲料购自上海灵朴生物科技有限公司[苏饲证(2014)01008]，配方(OC30002)如下： 普通饲料 74.5%，猪油10%，胆固醇0.5%，蛋黄粉10%，蔗糖5%。动物房温度18～24℃、自然光照，昼夜交替12 h，每只兔喂饲料100 g/d，自由饮水，单笼喂养。按实验动物使用3R原则对实验兔给予人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

Vivid E9超声诊断仪购自美国GE公司; 酶标仪(450 nm)购自美国伯腾仪器公司，兔低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)酶联免疫分析试剂盒均购自上海江莱生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制备及分组 随机分成2组，每组各10只。A组行颈总动脉内膜空气干燥法： 麻醉后(质量分数10%水合氯醛, 3～3.5 mL/kg)备皮、消毒, 颈部正中切口切开，充分暴露左侧颈总动脉。动脉夹夹闭血管近心端及远心端。4号头皮针沿血管长轴刺穿，生理盐水冲管后通气(120 mL/min) 5 min，随后再次往管腔内注入生理盐水，松开动脉夹，按压止血。待出血停止后，缝合皮肤。B组行颈总动脉外膜套环法： 准备工作如前，充分暴露左侧颈总动脉，将内径1.0 mm的薄壁硅橡胶管套住颈总动脉外膜，硅胶管均长5 mm。硅橡胶开口处使用粘合剂封闭。术后高脂饲料喂养12周。

1.3.2 观测指标 ①ELISA法测量血浆TC、TG及LDL： 术后高脂饲料喂养0周、4周及8周, 分别经耳中动脉用EDTA真空抗凝管取血2 mL, 1 118 ×g离心5 min，取血浆弃红细胞，再6 440 ×g离心3min，取上清-80℃保存。待血样收集完毕按ELISA试剂盒说明书操作。②兔颈动脉超声检查：术后高脂饲料喂养4周、8周及12周，分别使用GE vivid E9超声诊断仪检查2组兔颈动脉。兔备皮后仰卧位固定于实验台，沿着气管两侧找到颈总动脉，探头选用9L，频率8～10 MHz，调节至图像清晰，先长轴再短轴，自上而下地检查颈总动脉，观测颈总动脉内膜、管径及斑块形态。③兔颈总动脉病理学观察： 实验结束时，空气栓塞法处死全部动物。取有斑块的颈总动脉段，送医院病理科行HE染色后做病理学观察。

表1 兔血清TG、TC、LDL的浓度 mmol·L-1

1.4 统计学分析

应用 SPSS23.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以s表示，同一组高脂饲料前后的血脂水平比较采用配对t检验，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血脂水平

高脂饮食4周后血清TG、TC、LDL的浓度升高(P＜0.05)，并持续升高。而同一时间A组与B组间上述指标未见明显差别(P＞0.05)(表1)。

2.2 超声检测颈总动脉

A、B组白兔颈总动脉内中膜在8周左右明显增厚，且B组颈总动脉狭窄处内中膜增厚较明显，血流速度也较快(表2、表3)。4周时两组实验兔管壁均未见明显斑块，管腔内血流信号充盈良好。而8周时硅胶环组部分实验兔颈总动脉内可见小斑块突向管腔，彩色多谱勒血流图(CDFI)可见斑块处血流绕行，未见明显狭窄(图1)。12周时，两组实验兔颈总动脉内均见斑块回声。

2.3 病理学检查

12周时A、B两组兔未手术侧颈动脉仅可见内膜不规则增厚, 内皮细胞连续性尚好(图2A和图2B)。而手术侧可见内皮细胞形态不规整, 伴有不同程度的连续性中断, 病灶内膜下见泡沫细胞, 表层纤维帽结构断裂, 弹力纤维破坏变薄, 平滑肌细胞向内膜增生,可见斑块突向管腔(图2C、图2E), 且B组(图2C、图2D)病变较A组(图2C、图2E)更为明显。

表3 套环法兔颈总动脉超声检测

图1 二维超声兔颈动脉斑块

图2 兔颈动脉病理学观察

3 讨论

高胆固醇血症是动脉粥样硬化的始动因素，实验中兔在高脂高胆固醇饮食后，4周即可测得血TG、TC和LDL浓度升高，并随时间推移持续升高。但是单纯高脂喂养建模有一定的局限性，比如动脉粥样硬化斑块出现位置不可控，其次兔的动脉粥样硬化斑块主要为纤维增生性病变为稳定性斑块，不似人类的易损斑块[5]。

LeVeen等[6]在1982年首次采用通入干燥气体直接损伤血管内壁, 结合高脂饮食, 制备兔股动脉粥样硬化斑块模型。此方法对颈总动脉损伤仅局限于内膜，不会影响中膜，虽然内皮细胞修复与内膜增殖的过程更加接近颈动脉疾病的生理过程，但是影响因素较单一[7]。1997 年，Booth等[8-10]报道在高脂血症兔的颈动脉外膜植入硅橡胶圈(套环法)，以得到颈动脉斑块模型，套入硅橡胶一方面人为造成颈总动脉狭窄, 改变局部血流动力学, 另一方面硅橡胶套的机械刺激可引发血管局部炎性反应，促进动脉班块形成。故套环法可以缩短颈动脉斑块建模时间。本研究超声结果显示，同样饲养条件下，A、B两组兔中未受人为破坏侧的动脉，内中膜变化出现时间晚，亦未见斑块形成。两组手术侧颈总动脉均在喂养4周见内中膜增厚(表2和表3)并在8周和12周时可陆续扫查到颈总动脉斑块。B组手术侧颈总动脉斑块形成较A组早，多数在8周即可发现凸向管腔的斑块回声。术后12周B组存活5只兔(存活率50%)，其中3只检出颈动脉斑块，且斑块多发生在狭窄处近心端颈动脉段。A组存活4只兔(存活率40%)，仅2只建模成功。

病理学观察也证实了超声检查结果。当颈总动脉出现斑块时, HE染色光学显微镜下见动脉内膜形态不规整、不连续, 内弹力膜中断, 显示不清, 平滑肌细胞向内膜增生, 可见斑块凸向管腔。

在实验过程中我们发现，术后1周B组兔存活率为90%, A组兔存活率为70%，实验结束时B组存活率50%，而A组为40%。这可能与A组手术时间较长，术中血流阻断时间过长有关，或许可以推测套环法较空气干燥法安全简便。