基于网络药理学的六味五灵片抗乙型病毒性肝炎作用机制的初步研究Δ

张 静，杜凤霞，于珊珊，蔡华丹，刘丽萍

(解放军总医院第五医学中心药学部，北京 100039)

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)(属嗜肝DNA病毒科[1])感染引起的以肝脏炎性病变为主的并可引起多器官损害的一种传染病。该病可广泛流行于世界各国，一年四季均可发病，但多属散发；临床起病缓慢，以亚临床型及慢性型较常见，并使患者死于肝硬化和肝癌的风险增加[2]。近年来，乙型病毒性肝炎发病率呈明显升高趋势，全球HBV感染者多达3.6亿，我国约有1.2亿感染者，乙型病毒性肝炎已成为我国严重的公共卫生问题[3]。六味五灵片是2006年获得批准上市的国家三类中药，其处方来源于解放军总医院第五医学中心(原解放军第302医院)，其组方由南五味子、连翘、女贞子、莪术、苣荬菜和灵芝孢子粉6味中药构成，可滋肾养肝、活血解毒，用于治疗慢性乙型肝炎氨基转移酶升高，中医辨证属于肝肾不足、邪毒瘀热互结，症见胁肋疼痛，腰膝酸软，口干咽燥，倦怠、乏力，纳差，脘腹胀满，身目发黄或不黄，小便色黄，头昏目眩，两目干涩，手足心热，失眠多梦，舌暗红或有瘀斑、苔少或无苔，脉弦细。该药临床疗效好、使用量大，2007年荣获第三届“中国肝类用药市场十大影响力品牌”称号。

中药及其复方具有多成分、多靶点和多途径的临床作用特点，这种复杂性使得中药药效物质基础不明确、作用机制不清楚、中药材质量难控制和临床缺乏科学合理的药效及安全性评价体系，从整体到组织器官、细胞和分子水平都很难进行全面、系统的研究，从而使得中医药的现代化发展缓慢。因此，阐明中药的药效物质基础、作用靶点是推动中医药现代化的重要环节[4]。网络药理学基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络的基础，通过分析基因网络库、蛋白网络库、疾病网络库和药物网络库等现有数据库的信息资料[5]，采用计算机虚拟计算构建生物信息网络并分析网络拓扑结构[6]，从整体上预测中药复方的作用靶点。本研究基于网络药理学，初步探究六味五灵片抗乙型病毒性肝炎的潜在作用靶点。

1 资料与方法

1.1 资料来源

数据库和软件主要包括：中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[7]、人类孟德尔遗传综合数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM)(https://www.omim.org/)、UniProt(https://www.uniprot.org/)、DAVID数据库(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)(https://david.ncifcrf.gov/)、交互蛋白数据库(database of interacting protein，DIP)(http：//dip.doembi.ucla.edu)和Cytoscape 3.7.1软件。

1.2 方法

1.2.1 六味五灵片的主要化学成分及其作用靶点挖掘：采用TCMSP数据库，检索六味五灵片中的主要化学成分，根据各化合物的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、类药性(drug-likeness，DL)筛选出符合条件的化合物，以“OB≥30%，DL≥0.18”作为筛选条件。基于TCMSP数据库，将六味五灵片中的有效化合物逐一配对潜在作用靶点蛋白，利用Uniprot数据库得到各靶点蛋白对应的基因名称和Uniprot数据库识别码。

1.2.2 乙型病毒性肝炎靶点筛选：通过OMIM数据库，筛选乙型病毒性肝炎相关基因和蛋白靶点，建立乙型病毒性肝炎靶点数据集，其中靶点连接蛋白通过DIP数据库获得。为便于分析，将上述所有靶点转化为Uniprot数据库识别码格式。

1.2.3 “化合物-靶点-疾病”交互网络的构建和分析：将筛选到的化合物成分、成分作用靶点、疾病作用靶点和交互蛋白之间的交互关系通过“蛋白质-蛋白质”交互网络数据库进行分析。分析结果导入Cytoscape 3.7.1软件中进行可视化，同时分析直接靶点的拓扑参数。

1.2.4 基因本体(gene ontology，GO)生物过程和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析：将Cytoscape 3.7.1软件分析得到的直接作用靶点的Uniprot数据库识别码导入功能注释工具DAVID中，以P<0.01为阈值，筛选排序居前20位的GO生物过程和KEGG代谢通路[8]。

2 结果

2.1 化合物收集及其相关作用靶点筛选

六味五灵片中化合物成分共389个，符合筛选条件的主要化合物48个(见表1)，在TCMSP数据库中逐一对应相关作用靶点，重复靶点仅保留1个，共得到主要化合物相关作用靶点蛋白242个，然后将每种蛋白名称输入Uniprot数据库中，来源选“Human”，得到对应的靶点基因名称。

2.2 乙型病毒性肝炎靶点获取结果

基于OMIM数据库，共筛选得到301个疾病相关靶点。

2.3 网络构建和分析

为客观揭示六味五灵片抗乙型病毒性肝炎的可能活性化合物及潜在作用靶点，基于网络药理学分析，构建了“成分-靶点-疾病”交互网络并进行可视化分析，使六味五灵片抗乙型病毒性肝炎直观呈现出来，并对各靶点的相关参数进一步分析，见图1—2，图中，三角形为候选活性化合物，正方形为药物和疾病共同直接作用靶点，圆形为药物与疾病作用靶点。六味五灵片抗乙型病毒性肝炎的“成分-靶点-疾病”交互网络中，共筛选得到8个抗乙型病毒性肝炎主要活性成分和7个直接作用靶点，见表2—3。

图1 六味五灵片抗乙型病毒性肝炎的“化合物-靶点-疾病”交互网络Fig 1 Interactive network of “compound-target-disease” of Liuwei Wuling tablets against viral hepatitis B

图2 六味五灵片抗乙型病毒性肝炎直接作用靶点一级“成分-靶点-疾病”交互网络Fig 2 Direct targets of the first class interactive network of “compound-target-disease” of Liuwei Wulin tablets against viral hepatitis B

表1 候选化合物基本信息Tab 1 Basic information of candidate compounds

2.4 直接作用靶点GO生物过程和KEGG通路富集分析

GO生物过程分析共富集得到10个条目，见图3；KEGG通路注释分析共得到可能相关的通路10条，分别为“Cytokine-cytokine receptor interaction”(细胞因子-细胞因子-受体相互作用)、“Asthma”(哮喘)、“Allograft rejection”(移植排斥反应)、“Pathways in cancer”(恶性肿瘤的途径)、“Amyotrophic lateral sclerosis(ALS)”(肌萎缩侧索硬化)、“Melanoma”(黑色素瘤)、“Colorectal cancer”(结直肠癌)、“Apoptosis”(细胞凋亡)、“Prostate cancer”(前列腺癌)和“Systemic lupus erythematosus”(系统性红斑狼疮)，见图4。

表2 六味五灵片中预测主要活性成分Tab 2 Predicted active ingredients of Liuwei Wuling tablets in Liuwei Wulin tablets

表3 六味五灵片抗乙型病毒性肝炎“成分-靶点-疾病”交互网络中直接作用靶点拓扑参数分析Tab 3 Topological parameter analysis of direct targets of the first class interactive network of “compound-target-disease” of Liuwei Wulin tablets against viral hepatitis B

图3 六味五灵片抗乙型病毒性肝炎直接作用靶点的GO生物过程Fig 3 GO biological process of direct targets of Liuwei Wulin tablets against viral hepatitis B

图4 六味五灵片抗乙型病毒性肝炎直接作用靶点的KEGG代谢通路Fig 4 KEGG Pathway analysis of direct targets of Liuwei Wulin tablets against viral hepatitis B

3 讨论

六味五灵片为中药复方制剂，具有保肝、抗炎、解毒及改善肝组织病理等优点，可以有效减轻肝损伤，延缓慢性肝病的发展进程，临床上常与抗病毒药联合应用以达到治疗效果[9]。本研究基于网络药理学方法，系统地对六味五灵片抗乙型病毒性肝炎的潜在靶点进行挖掘，最终得到7个直接作用靶点蛋白(肝细胞生长因子受体、雄激素受体、周期蛋白A2、白细胞介素10、肿瘤坏死因子、细胞肿瘤抗原p53和含杆状病毒IAP重复序列的蛋白质5)、10条GO生物过程及10条KEGG代谢通路。

肝细胞生长因子受体是酪氨酸激酶膜受体，其不仅对肝脏再生、肿瘤发生发展发挥着重要作用，而且在其他组织如肾脏、肺、乳腺、肌肉和神经组织的发育、再生及体内平衡中不可或缺[10]。目前，性别因素与乙型病毒性肝炎相关性的研究主要集中于性甾体激素及其受体，性甾体激素分泌及其受体表达水平对慢性乙型肝炎发病和进展的影响可能表现在2个方面，即：病毒复制及其抗原表达水平；宿主的免疫应答效度性别和年龄差异[11]。周期蛋白A主要参与细胞分裂S期和G2-M期的调节，其过表达将使细胞过度增殖，从而影响细胞周期的进程；而且，周期蛋白A的差异表达可能是HBV感染后肝细胞癌变的重要原因[12]。白细胞介素10具有促炎和耐受的双重作用，可以预测乙型病毒性肝炎慢性化及病毒持续感染，参与免疫细胞、炎症细胞及肿瘤细胞等多种细胞的生物调节[13]。肿瘤坏死因子是一种重要的炎性因子，其过度分泌可以促进HBV在肝细胞内的复制，但其水平的升高也是病毒复制活跃的患者体内的保护性反应[14]。

中药成分复杂，具有多靶点、多环节和多效应的作用特点，在临床应用中可达到整体治疗效果。但由于其药物种类繁多、活性成分不明确以及作用机制模糊，在临床上很难做到靶向治疗，因此，对于一些急症、重症无法达到理想的治疗效果。本研究依托网络生物信息及计算机虚拟分析，对中药复方潜在作用靶点进行初步挖掘，可为中医药的现代化研究提供一定参考；但由于分析过程中并未考虑中医“君臣佐使”配伍关系及用法、用量等因素[15]，故其结果尚需进一步动物实验和临床试验验证。