黄连和枸杞子对抗精神病药奥氮平引起胰岛素抵抗的干预研究△

刘守青，吕一帆，杨妮，李士红，张中健，王伽伯，黎维勇*，彭世勇*

1.新乡医学院 精神神经医学研究院，河南 新乡 453000；2.华中科技大学 同济医学院 附属协和医院，湖北 武汉 430022；3.中国人民解放军总医院 第五医学中心 全军中医药研究所，北京 100039

精神分裂症(schizophrenia)是一组病因未明的精神疾病，以情感和行为等多方面的障碍为主要临床特征。它在世界范围内影响着1.3%的人群[1]，使患者预期寿命减少10～20年[2]。奥氮平作为第二代抗精神病药(Second generation antipsychotics，SGAs)已经成为临床抗精神分裂症的常用药。然而，临床实践发现长期服用奥氮平会引起炎症因子[3]及胰岛素通路相关蛋白异常[4-8]，会产生胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)并最终导致糖尿病[9]，从而影响奥氮平的用药安全及依从性，然而奥氮平引起IR的机制仍尚未完全阐明。当代研究表明黄连、枸杞子等单方在糖尿病治疗应用中有显著效果[10-11]。奥氮平引起的胰岛素抵抗是否能够用中药改善，目前鲜见报道。本实验采用长期服用奥氮平构建的大鼠胰岛素抵抗模型，进一步探究黄连、枸杞子对胰岛素抵抗大鼠的干预作用。

1 材料

黄连(批号：808109，湖北辰美中药饮片有限公司)；枸杞子(批号：812101，湖北辰美中药饮片有限公司)。奥氮平(批号：LRAA9505，Sigma，含量>99%)；抗体(NF-κB，Cat：#8242，CST，美国，1∶1000；GGPPS，Cat：ab167168，abcam，英国，1∶2000；FAT，Cat：ab64014，abcam，英国，1∶2000；GRK2，Cat：#3982，CST，美国，1∶1000；ATGL，Cat：ab207799，abcam，英国，1∶1000；PTP1B，Cat：ab189179，abcam，英国，1∶500；GAPDH，Cat：G9545，sigma，美国，1∶5000)；胰岛素ELISA试剂盒(E-EL-R2466c，伊莱瑞特)；IL-1β(E-EL-R0012c，伊莱瑞特)；IL-6(E-EL-R0015c，伊莱瑞特)；TNF-α(E-EL-R0019c，伊莱瑞特)；血糖仪及血糖试纸(罗氏诊断产品有限公司)；BCA蛋白质浓度测定试剂盒(AS1086，ASPEN)；PBS溶液(AS1044，ASPEN)；实验用水为超纯水。黄连和枸杞子均采用10倍水煎煮，黄连煎液含小檗碱为32.8 mg·mL-1，枸杞煎液含甜菜碱为104 ng·mL-1。

2 方法

2.1 实验动物

40只8周龄SPF级雌性SD大鼠，购自湖北省疾控中心，动物实验使用许可证号为：SYXK(鄂)2010-0057。随机分为对照组(BL)、奥氮平组(OLZ)、黄连组(CR)、枸杞子组(LF)，每组10只。根据临床上奥氮平多巴胺受体占用率[12]，确定SD大鼠单日剂量1.5 mg·kg-1，灌胃8周，奥氮平组胰岛素抵抗指数与对照组有统计学差异表明建模成功。根据《中华人民共和国药典》推荐，黄连以内服煎汤最大剂量5 g·d-1换算成大鼠剂量514 mg·kg-1灌胃给药，枸杞子以内服煎汤最大剂量12 g·d-1换算成大鼠剂量1.234 g·kg-1灌胃给药。奥氮平组和黄连组、枸杞子组每天灌胃奥氮平1.5 mg·kg-1，然后再分别对黄连组、枸杞子组灌胃中药，空白组给予同等剂量的无菌0.9%氯化钠溶液灌胃。各组SD大鼠每天灌胃处理，连续喂养8周。

2.2 空腹血糖及胰岛素抵抗指数测定

大鼠禁食12 h后，第2、4、6、8周从大鼠的眼眶后静脉丛采血，用血糖仪测血糖水平。其余的血液样品置于添加了肝素的EP管中，收集血浆，并采用胰岛素ELISA试剂盒测定雌性SD大鼠血浆中胰岛素水平。有研究表明，奥氮平导致的糖尿病发生和进展中的主要病理生理因素是引起了胰岛素抵抗，而胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment insulin，HOMA-IR)是评估糖尿病一级预防的关键指标[13]。按公式(1)计算HOMA-IR，评估大鼠的胰岛素敏感性。

(1)

2.3 蛋白质免疫印迹(Western-blot)和ELISA实验

第8周大鼠禁食12 h后，采集大鼠眼眶后静脉丛血样，置于添加了肝素的EP管中，并分离腹膜后白色脂肪组织在-80 ℃下保存备用。采用Western-blot技术，电泳电压80 V，电泳至分离胶后将电压改成120 V；采用电流300 mA，90 min转膜；5%脱脂奶粉封闭2 h；一抗抗体按说明书进行配比，一抗4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次10 min；二抗室温孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；曝光仪曝光。测定SD大鼠脂肪组织中NF-κB、FAT、GGPPS、PTP-1B、GRK2和ATGL的蛋白表达水平。检测第8周血浆中炎症因子，采用ELISA试剂盒测定IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平。

2.4 统计分析

3 结果

3.1 黄连、枸杞子降低奥氮平组大鼠的胰岛素抵抗

测量大鼠空腹血糖、胰岛素水平并计算胰岛素抵抗指数。空腹血糖结果如图1A所示，对比于BL组，OLZ组大鼠在第6、8周空腹血糖值显著升高了25%、17%(P<0.05)。对比于OLZ组，LF组的大鼠第6、8周空腹血糖值显著降低了11%、13%(P<0.05)。结果表明8周后，枸杞子可以显著降低奥氮平导致的高空腹血糖水平，黄连并未有此效果。大鼠血浆胰岛素结果如图1B所示，对比于BL组，OLZ组大鼠在第2、4、6、8周胰岛素水平显著升高了49%、74%、69%、45%(P<0.05)。对比于OLZ组，CR组的大鼠第2、4、6、8周胰岛素水平分别降低了19%、31%、33%、31%(P<0.05)。对比于OLZ组，LF组的大鼠第4、6、8周胰岛素水平显著降低了26%、23%、28%(P<0.05)。结果表明从第四周开始，黄连、枸杞子均可以显著降低奥氮平引起的高胰岛素水平。HOMA-IR结果如图1C所示，对比于BL组，OLZ组大鼠在第2、4、6、8周HOMA-IR显著升高了29%、84%、114%、70%(P<0.05)。对比于OLZ组，CR组的大鼠第4、6、8周HOMA-IR显著降低了32%、37%、36%(P<0.05)。对比于OLZ组，LF组的大鼠第4、6、8周HOMA-IR显著降低了29%、32%、37%(P<0.05)。结果表明黄连、枸杞子均可以显著降低奥氮平引起的HOMA-IR的升高。

注：A.空腹血糖；B.胰岛素；C.胰岛素抵抗指数；与对照组比较，*P<0.05；与奥氮平组比较，#P<0.05；下同。图1 各组大鼠空腹血糖、胰岛素水平及胰岛素抵抗指数的比较

3.2 黄连和枸杞子抑制奥氮平组大鼠脂肪组织中NF-κB的水平

本实验室前期研究已经发现奥氮平引起炎症反应[3]，并且引起NF-κB的活化，NF-κB可在组织细胞内启动炎症反应[14-15]，这些是导致胰岛素抵抗的重要因素。本研究通过蛋白质印迹技术全面分析大鼠脂肪组织样本，各组样本加样顺序如图2A所示。灰度值分析结果如图2B显示，与对照组对比，奥氮平组、黄连、枸杞子组中的NF-κB表达量分别增加了453%、227%、171%(P<0.05)。但黄连、枸杞子组对比于奥氮平组，脂肪组织的NF-κB分别显著降低了41%、51%(P<0.05)。结果表明黄连、枸杞子组NF-κB并未恢复到对照组的正常水平，即使如此，黄连和枸杞子依然显著降低了奥氮平组中的NF-κB水平。

注：A.蛋白质印迹技术代表胶片；B.蛋白质印迹灰度。图2 各组大鼠脂肪组织NF-κB比较

3.3 黄连、枸杞子降低奥氮平组大鼠血浆中炎症因子的水平

为了阐明黄连、枸杞子对奥氮平组大鼠血浆中炎症因子表达的影响，本实验采用ELISA检测了大鼠血浆中炎症因子的表达水平。如图3所示，与对照组相比，奥氮平组大鼠的炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6分别显著增加了91%、118%、147%(P<0.05)。对比于奥氮平组，黄连组的炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6分别显著降低了43%、49%、48%(P<0.05)，枸杞子组的炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6分别显著降低了44%、47%、48%(P<0.05)。结果表明黄连、枸杞子显著降低奥氮平组的炎症因子水平，且已恢复至正常状态。

注：A.IL-1β；B.TNF-α；C.IL-6。图3 各组血浆炎症因子箱形图

3.4 黄连和枸杞子降低奥氮平组大鼠脂肪组织中胰岛素抵抗相关蛋白的表达

研究发现FAT在体内的表达上调有促进脂肪形成的功能，同时FAT水平升高会增加胰岛素抵抗的风险[4]。PTP-1B敲除的小鼠会失去对胰岛素和瘦素信号的传导抑制，小鼠在高脂饮食下不出现肥胖或胰岛素抵抗[5]。在脂肪细胞中，可通过GGPPS阻断胰岛素信号通路导致胰岛素抵抗[6]。GRK2是胰岛素作用的重要负调节因子，是胰岛素抵抗和肥胖发病机理的关键因素之一[7]。ATGL分解的游离脂肪酸利用率下降，提高了葡萄糖的利用率，进而增加葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性[8]。以前的研究发现这些脂肪细胞信号蛋白表达异常是胰岛素抵抗的关键因素，并且在糖尿病疾病中高度活化。蛋白质印迹技术全面分析各组样品，如图4A所示。图4B～F的灰度值统计结果显示与对照组对比，奥氮平组中FAT、GGPPS、PTP-1B、GRK2和ATGL的平均相对表达水平分别升高了425%、257%、513%、178%、166%(P<0.05)。对比于奥氮平组，黄连组的FAT、GGPPS、PTP-1B、GRK2和ATGL的平均相对表达水平分别显著降低了57%、39%、55%、50%、51%(P<0.05)，枸杞子组的FAT、GGPPS、PTP-1B、GRK2和ATGL的平均相对表达水平分别显著降低了66%、43%、61%、58%、45%(P<0.05)，结果表明黄连、枸杞子组显著降低了奥氮平组中胰岛素抵抗相关蛋白的表达量。对比于对照组，黄连组中GGPPS、PTP-1B仍然增加了116%、173%(P<0.05)，枸杞子组中GGPPS也增加了104%(P<0.05)，表明GGPPS可能在黄连和枸杞子降低胰岛素抵抗中不起主要作用，PTP-1B可能在黄连组降低胰岛素抵抗中不起主要作用。总之，这些数据表明黄连、枸杞子对奥氮平组中胰岛素抵抗相关蛋白FAT、GGPPS、PTP-1B、GRK2和ATGL异常表达有明显改善作用。

注：A.蛋白质印迹技术代表胶片结果；B～F.蛋白质印迹灰度值分析。图4 各组大鼠脂肪组织胰岛素抵抗相关蛋白比较

4 讨论

已有研究表明抗精神病药奥氮平治疗中伴发IR及糖脂代谢异常[16]，成为了奥氮平临床治疗中不可回避的问题，严重影响着临床奥氮平长期治疗的依从性；并且有研究表明胰岛素抵抗和炎症反应有密切相关性[17]，NF-κB是组织细胞内普遍存在的可诱导核转录激活的因子，对启动、调节炎症反应起关键作用[18]。在雌性大鼠[19]、健康男性受试者[20]长期服用或细胞实验[21]给药奥氮平后可以引起炎症反应，某些研究甚至认为IR是一种慢性炎症状态[22]。已有研究表明FAT、GGPPS、PTP-1B、GRK2和ATGL这些脂肪细胞信号蛋白高度表达是产生IR的关键因素[4-8]。临床上通常是在患者出现这些不良反应后进行对症处理，对奥氮平进行减量、联合其他药物治疗或更换其他药物。已有研究使用二甲双胍[23]、托吡酯[24]、倍他司丁[25]、阿立哌唑[26-27]等可以减轻抗精神病药物治疗引起的不良反应，但治疗效果有限或不适合长期给药，甚至可能引起其他不良反应。因此，寻找一种有效且不良反应小的药物来治疗奥氮平等非典型抗精神病药引起的代谢相关不良反应或者找到治疗这些不良反应的靶点至关重要。

黄连口服不良反应小、安全性好，枸杞子则是药食两用的中药。这些特性是今后有效筛选中药复方和新药改善抗精神分裂药物奥氮平所致胰岛素抵抗防治的重要基础。尽管前人研究表明黄连、枸杞子对高糖诱导的胰岛素抵抗有干预作用[28-29]，黄连可以通过改善内质网应激[30]，激活AMPK[31]，反转IRS磷酸化[32]等方式降低胰岛素抵抗。枸杞子可以通过提高胰岛素信号传导通路相关蛋白IRS2、PI3K、Akt、GLUT2的表达[33]，降低resistin基因mRNA表达[34]等方式改善胰岛素抵抗。黄连中小檗碱[35]、药根碱[36]等具有改善胰岛素抵抗、降低血糖的作用，枸杞子的有效成分枸杞多糖[37]能通过提高2型糖尿病大鼠的胰岛素敏感性，实现降低血糖的作用。但这两味中药对奥氮平引起的胰岛素抵抗的干预机制，尚未有文献报道。因此本研究旨在通过动物实验探讨黄连、枸杞子对奥氮平灌胃所致的大鼠IR相关代谢指标的改善作用。HOMA-IR是衡量IR的指标[38]，本结果显示奥氮平组HOMA-IR显著高于对照组，表明大鼠长期服用奥氮平已产生胰岛素抵抗。黄连、枸杞子均显著降低了奥氮平引起的高胰岛素和高HOMA-IR水平，但只有枸杞子显著降低了奥氮平引起的高血糖水平。这些结果表明黄连通过降低胰岛素水平改善HOMA-IR，枸杞子通过降低血糖和胰岛素水平改善HOMA-IR。此外，黄连、枸杞子对于降低奥氮平组NF-κB、炎症因子(IL-1β、TNF-α、IL-6)、IR相关蛋白也有显著效果，但是对其中的GGPPS、PTP-1B并未恢复到正常对照的水平(见图2)。这些结果表明奥氮平诱导的胰岛素抵抗可能有更复杂的机制存在，提示今后可以从中药配伍复方方面改善奥氮平的不良反应。

本研究首次运用黄连、枸杞子对奥氮平引起的胰岛素抵抗大鼠模型进行干预治疗，取得了良好效果，为治疗抗精神病药奥氮平引起的胰岛素抵抗和新生糖尿病联合用药提供了新的思路。虽然本次研究没有在前人研究提示基础上具体分析黄连、枸杞子的单分子成分是否有效抵抗奥氮平所致胰岛素抵抗作用，但是这些结果将为今后进一步研究黄连、枸杞子有效成分抗胰岛素抵抗和临床干预研究指明具体方向。